禽支原体感染在世界上分布广泛，鸡群中感染水平较高，常见的有鸡滑液囊支原体和鸡毒支原体。近年来，鸡滑液囊支原体发病率呈上升趋势[1]，是由鸡滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae，MS）感染引起，以跗关节渗出性的滑液囊膜炎和腱鞘滑膜炎为特点的慢性或急性传染病[2]。各品种鸡均易感染，以雏鸡为首。流行病学调查显示，在东欧、荷兰、墨西哥、阿根廷均存在MS感染[3-4]；美国商品蛋鸡普遍感染[5]；西欧弗兰德斯地区感染率达76.3%[6]。MS一年四季均会发生，春、冬两季比较常见，主要传染源是病鸡或存在隐性感染的鸡[7]。MS可以通过种鸡蛋进行垂直传播，也通过饲养人员携带、饮用水污染等因素进行直接或间接的水平传播[8]。不同菌株的感染对鸡致病性不尽相同[9]，能够引起不同程度的亚临床型上呼吸道感染、关节炎和传染性滑膜炎，使鸡的生长发育缓慢、鸡肉品质下降，严重时会引起鸡免疫系统的抑制[10]。鸡场一旦发生该病，很难根除，给养殖场带来难以估量的损失。现有云南昆明某鸡场中的鸡出现陆续瘫痪死亡，部分鸡喜卧、站立不稳、脚垫增厚、跗关节明显肿大（飞节和趾节较为严重）、用手触摸有波动感，诊断疑似为MS感染。本试验通过病鸡的临床症状诊断、病理组织剖检、血清平板凝集试验、PCR检测、基因序列比对和同源性分析进行综合诊断，最终确诊为MS感染，为进一步防控和净化鸡滑液囊支原体病提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1样品采集2019年12月采自云南昆明某肉鸡养殖公司具有MS典型症状的病鸡样品3只。1.1.2试剂及耗材TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、2xEasyTaq PCR SuperMIX（tdge）均购自北京全式金生物技术有限公司。阳性参考菌株、滑液囊支原体平板凝集试验抗原、阳性血清均购自中国兽医药品监察所。1.2试验方法1.2.1血清平板凝集试验参照GB/T 17999.4—2008《血清平板凝集试验》要求进行样品的血清平板凝集试验。1.2.2引物的合成根据GenBank中公开发表的MS的基因序列，利用Oligo7设计1对引物，MS-F引物：AAATCAGGCTCGGGCCCT，MS-R引物：AGTAACCGATCCGCTTAATGC，扩增片段374 bp，由生工（上海）生物工程有限公司合成。1.2.3病料采集及DNA提取无菌采集肿胀关节腔内的关节液渗出物和内容物、胸部龙骨旁干酪样坏死物和增厚脚垫内容物，黏液用生理盐水稀释。按照TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0使用说明书提取DNA，共提取3份DNA。1.2.4PCR检测利用MS检测引物MS-F、MS-R对上述提取的DNA进行PCR扩增。PCR反应体系25 μL：2×Easy TaqSuperMix（tdge）12.5 μL、sterile ddH2O 9.5 μL、上下游引物各1 μL。1号加1 μL阳性菌株DNA；2号加1 μL的ddH2O；3、4、5号各加入1 μL的DNA模板。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，扩增35个循环；72 ℃延伸5 min。反应完成后把PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统上观察结果并拍照。使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收目的片段。1.2.5测序和核苷酸同源性分析将胶回收产物送至昆明擎科生物科技有限公司进行测序。测序的结果在NCBI数据库中进行比对，使用DNAStar软件，对3株分离株（YNKM1-2019、YNKM2-2019、YNKM3-2019）与GenBank中的16株MS参考毒株进行16S rRNA核苷酸序列同源性分析。参考毒株信息见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.018.T001表1参考毒株信息Tab.1Reference strain information毒株名称登录号地区年份MSO1KT880075Iran2016IRG2/C/08KP659459Iran Kerman2015MSK-1KC832817Israel2013MSR815JX233548Iran2012B22/91FN666084South Africa2018IZSVE/2953/MAVMH679887Italy2018CBU091119KM986006South Korea2014CBU0866KM985992South Korea2014F130-16PLMF737496Poland2018PASC8LT615237Spain2016189/NLD/13KU251397Holland2016B38-96-170AJ580985Scotland2016K1938DQ6661613Australia2016K870NZMSID214MS087/ISR/11KJ606930AB507394KU251295USAJapanHolland2014201620162结果与分析2.1病鸡临床症状和病理变化（见图1）对病鸡进行抗生素治疗，效果不明显，发病数量仍在增加。询问免疫程序，1日龄接种马立克病疫苗；4日龄接种传染性支气管炎疫苗；7、21日龄接种新城疫疫苗；14、28日龄接种法氏囊疫苗。所观察的鸡为2只土杂鸡、1只瑶鸡。由图1可知，临床症状为病鸡鸡冠轻微萎缩呈苍白色、羽毛混乱、消瘦脱水、常缩头闭眼、行走时步态蹒跚；跗骨关节肿胀变粗（飞节和趾节较为严重）、用手触摸有波动感、脚垫增厚严重、行走的姿态呈轻微的八字步、胸部的皮下组织发生肿胀。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.018.F001图1病鸡病理变化Fig.1Pathological changes in sick chickens病理变化：剖检病鸡肿胀的关节和脚掌末端，发现有大量黏稠的黄色脓液的流出、胸部触摸明显增厚、有坏死灶形成；剖检病鸡的腺胃，发现里面基本没有内容物、看不到明显的病理变化、脾肾等器官正常；剖检病鸡的气管未发现出血点，只有少量黏液。2.2病鸡血清平板凝集试验结果（见图2）由图2可知，经过血清平板凝集试验检测，3份血清阳性率为100％。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.018.F002图2病鸡平板凝集试验结果Fig.2Plate agglutination test results in sick chickens2.3PCR扩增结果（见图3）由图3可知，在374 bp位置可见清晰、明亮的特异性条带，与预期条带相符。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.018.F003图3PCR产物电泳结果Fig.3The electrophoresis result of PCRproduct注 ： 1为DL2000 Marker；2为阳性对照；3为阴性对照；4~6为3株2019年分离株的扩增产物。2.4同源性分析结果（见图4）XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.018.F004图4同源性分析结果Fig.4Homology analysis results对分离株YNKM1-2019、YNKM2-2019、YNKM3-2019与GenBank中的16株参考毒株进行序列同源性分析。由图5可知，YNKM1-2019与16株参考序列同源性为94.2%~99.6%，其中与MS01-KT880075、IRG2-C-08-KP659459、MSR815-JX233548、MSK-1-KC832817的同源性最高，为99.6%，与K870-KJ606930的同源性最低，为94.2%。YNKM2-2019与16株参考序列同源性为94.2%~100%，其中与YNKM3-2019的同源性最高，为100%，与K870-KJ606930的同源性最低，为94.2%。YNKM3-2019与16株参考序列同源性为94.2%~99.6%，其中与MS01-KT880075、IRG2-C-08-KP659459、MSR815-JX233548、MSK-1-KC832817四株的同源性最高，为99.6%，与K870-KJ606930的同源性最低，为94.2%。3讨论近年来，云南省内MS发病率较高，但对本病的病原分离鉴定和相关研究较少。目前还未研发出针对性的药物，不能根除该病，只能控制鸡群感染率，降低发病率[11]。MS感染确诊的方法有病原分离鉴定、血清学方法和分子生物学方法等。病原分离鉴定可靠性较高，培养后分离细菌进行瑞士染色，在油镜下和培养基上观察形态来确定[12]。血清学诊断常用的有血清平板凝集试验、血凝抑制试验、酶连免疫吸附试验等[13]。临床中常用PCR检测法，该方法特异性强、敏感性高、耗时短、操作简单、准确性高[14-15]。为确保试验结果的准确性，最终需要使用多种检测方法来确诊。本研究采用血清学方法和病原分离鉴定对云南昆明某肉鸡场疑似感染MS的病鸡进行诊断。首先进行血清平板凝集试验，结果3份病料样品均为阳性；然后从特征性病理变化的肿胀关节内容物中提取DNA进行PCR扩增，扩增产物电泳结果显示，在374 bp处有清晰的特异性条带；最后将PCR产物回收后进行测序，结果与Genbank中下载的16条参考序列进行比对，再通过同源性分析发现其同源性在94.2%~99.6%之间，确诊为MS。4结论本试验对疑似MS感染的临床病料，通过提取DNA、PCR产物电泳结果显示，清晰无杂带即可快速诊断，为治疗该病节省时间，此方法适合规模化养殖的防控和净化监测。