根据代谢产物不同，可以将乳酸菌分为同质型乳酸菌和异质型乳酸菌。同质型乳酸菌的特点是同型发酵，它们可有效利用可溶性碳水化合物，增加乳酸的产量，迅速降低pH值。但是同质型乳酸菌发酵产生的挥发性脂肪酸含量低，对于酵母菌和霉菌等的抑制作用有限[1-2]。同质型乳酸菌产生的乳酸易被酵母菌利用，同质型乳酸菌发酵容易造成青贮饲料的腐败[3]。异质型乳酸菌在青贮发酵过程中会产生乳酸和乙酸。异质型乳酸菌发酵产乳酸效率低于同质型乳酸菌，且发酵时消耗底物的能量较多，但其重要的发酵产物乙酸可以抑制有害真菌的生长，有效减少青贮饲料开装后的营养损失，对提高青贮饲料的有氧稳定性具有积极的意义[4-5]。青贮饲料中有多种酵母菌，酵母菌可能是引起青贮饲料好氧变质的微生物[6-7]。目前，关于苏丹草青贮饲料有氧暴露过程中酵母菌群落动态的研究未见报道，发酵青贮饲料的有氧稳定机理仍不明确。试验以同/异质型乳酸菌为外源添加剂，探讨其对苏丹草青贮饲料有氧暴露过程中酵母菌群落的影响，明确酵母菌与苏丹草青贮饲料好氧变质过程的相关性，为进一步提高苏丹草青贮饲料的有氧稳定性提供参考。1材料与方法1.1材料与加工苏丹草种植于新疆农业大学三坪农场校内实习基地（新疆乌鲁木齐，43°54´N，87°19´E）。以抽穗期刈割的新苏3号苏丹草（新疆瑞吉兰德牧草种业有限公司提供）为青贮原料，将刈割后的苏丹草原料晾晒在水泥晾晒场中，其下铺1层干净的塑料薄膜，每2 h轻翻1次，晾晒8 h，晾晒后切短至1~2 cm，待贮。苏丹草原料青贮特性：凋萎8 h后的苏丹草干物质含量为311 g/kg FM、粗蛋白含量为114 g/kg DM、可溶性糖含量为92 g/kg DM、中性洗涤纤维为624 g/kg DM、酸性洗涤纤维为331 g/kg DM、粗脂肪含量为27.2 g/kg DM、粗灰分含量为65.3 g/kg DM、缓冲能为85.5 mmol/kg DM，pH值为4.91，附着的乳酸菌数量为3.26 lgCFU/g FM。添加剂为植物乳杆菌（L. plantarum，CGMCC，10474）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus，CGMCC，14463）和布氏乳杆菌（L. buchneri，CGMCC，14268）由中国农业大学草业科学与技术学院提供。1.2青贮试验方法空白为对照处理（CK组，不添加任何菌剂），植物乳杆菌L. plantarum（LP组，添加量为1×106 CFU/g）和鼠李糖乳杆菌L. rhamnosus（LR组，添加量为1×106 CFU/g）为同质型乳酸菌处理；布氏乳杆菌L. buchneri（LB组，添加量为1×106 CFU/g）为异质型乳酸菌处理。利用小型喷壶将菌液（已提前按比例配置好）均匀喷洒至晾晒8 h的苏丹草原料上，以5 L聚乙烯塑料桶为青贮容器制作青贮饲料。CK组喷洒等量的蒸馏水。每个处理重复9次，确保每桶青贮饲料的密度一致（3 200±100）g，18~34 ℃（室温环境）发酵60 d。发酵60 d后，每个组取3桶未开封的青贮饲料，测定发酵品质。从剩余未开封的6桶青贮饲料中，均匀的取100 g样品装入1 L的聚乙烯塑料瓶中，重复20次，每个处理取6瓶重新分装的青贮瓶，用宽松的塑料膜扎紧瓶口，塑料膜上扎数个小孔，置于室温环境下，记录青贮饲料的温度变化情况（联测_SIN-R8000D，杭州联测自动化技术有限公司），当样品温度超过环境温度2 ℃时停止进行记录。剩余的样品在有氧暴露的第0、2、4、6、8 d分别测定pH值及酵母菌数量及种类的动态变化。1.3指标测定及方法新鲜苏丹草样品65 ℃干燥48 h，粉碎，过40目筛孔。实验室内测定发酵饲料干物质（烘箱干燥法）、粗蛋白质（凯氏定氮法）、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维（Van Soest洗涤纤维素分析法）、粗脂肪（索氏抽提法）、粗灰分（GB/T 6438—2007）、可溶性糖含量（分光光度法）和缓冲能值（滴定法）[8]。参考王慧丽[9]方法进行苏丹草青贮饲料中酵母菌的分离、纯化、保存、鉴定及计数，采用平板计数法进行苏丹草及苏丹草青贮饲料中乳酸菌数量的测定[8]。采用雷磁酸度计测定苏丹草青贮饲料的pH值；采用高效液相色谱法测定乳酸，乙酸，丙酸、丁酸含量；采用苯酚-次氯酸比色法测定氨态氮含量[10]。V-score评分方法参考日本粗饲料评定手册（2001）[11]。1.4数据统计与分析在NCBI上进行酵母菌序列的比对分析，以MEGA 7.0进行酵母菌种群系统进化树的构建，以SigmaPlot 14.0进行相关图表的绘制，利用SPSS 22.0软件进行方差分析。2结果与分析2.1同/异质型乳酸菌对苏丹草青贮饲料发酵品质的影响（见表1）由表1可知，与对照相比，同/异质型乳酸菌处理可显著降低苏丹草青贮饲料的pH值、丁酸以及氨态氮含量（P0.05），显著提高苏丹草青贮饲料中的乳酸含量、乳酸/乙酸、乳酸菌浓度和V-score评分（P0.05）。所有处理组中，LP组苏丹草青贮饲料的pH值、乙酸、丙酸、丁酸和氨态氮含量最低，乳酸含量、乳酸/乙酸、乳酸菌浓度和V-score评分最高。V-score评分从高到低依次为LP组LB组LR组CK组，LP组的V-score达到97。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.027.T001表1同/异质型乳酸菌对苏丹草青贮饲料发酵品质的影响项目pH值乳酸/（g/kg DM）乙酸/（g/kg DM）乳酸/乙酸丙酸/（g/kg DM）丁酸/（g/kg DM）氨态氮/（g/kg TN）乳酸菌/（lgCFU/g FM）V-scoreCK组4.57a25.60d11.80b2.19d1.34a4.25a1150a4.28d49cLP组4.16c50.30a4.96d10.30a0.79b0.31c49.30b6.57a97aLR组4.24bc47.10b7.38c6.42b1.14a1.28b62.70b5.62b87bLB组4.32b40.50c17.40a2.34c1.20a1.30b53.70b4.92c89bSEM0.052.891.461.030.070.458.110.265.65P值0.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.001注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），相同小写字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.2同/异质型乳酸菌对苏丹草青贮饲料有氧稳定性的影响（见表2）由表2可知，与对照相比，同/异质型乳酸菌的添加显著提高苏丹草青贮饲料的有氧稳定时间（P0.05）。有氧稳定时间从高到低依次为LB组LR组LP组CK组，LB组苏丹草青贮饲料的有氧稳定时间最长为159 h，显著高于其他3个处理（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.027.T002表2同/异质型乳酸菌对苏丹草青贮饲料有氧稳定性的影响项目CK组LP组LR组LB组有氧稳定时间/h53c116b138b159a注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05）；下表同。2.3苏丹草青贮饲料中鉴定分离出的酵母菌（见图1）从苏丹草青贮饲料中共分离得到151株酵母菌。分离和纯化酵母菌，使用单链构象多态性分析对其进行初步筛选，进行26S rDNA的D1/D2区序列测定，通过BLAST在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列及相关信息检索，将酵母菌鉴定到种水平。通过Mega 7.0构建系统发育树。测定得到的序列与对应模式菌株序列的相似度，得到的序列与模式菌株的26S rDNA序列构建系统发育树，酵母菌的26S rDNA D1/D2区序列系统进化树见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.027.F001图1酵母菌的26S rDNA D1/D2区序列系统进化树注：Knuc，核苷酸替代值；节点数值为重复检验1 000次分配所得的靴值；括号内为基因收录号。由图1可知，所有分离得到的酵母菌菌株与GenBank上检索得到的模式菌株均处于同一分支且重复抽样分析值都在98%以上。因此，分离得到9种酵母菌与对应的模式菌株均属于同一种。2.4同/异质型乳酸菌对苏丹草青贮饲料有氧暴露过程中pH值及酵母菌群落的影响（见表3、表4）由表3可知，除LB和LR组外，第0 d时，在其余各组中均检测到拜氏接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）。随着有氧暴露天数的延长，所有处理组中的拜氏接合酵母（Z.bailii）比例不断提高。在LR组和LB组中，整个有氧暴露过程均未检测到毕赤克鲁维酵母（P. kudriavzevii）。有氧稳定时间最长的LB组中，酵母菌的种类最少，仅有拜氏接合酵母（Z.baili）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）、嗜酒假丝酵母（Candida ethanolica）和假丝酵母（Candida rugosa）4类。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.027.T003表3酵母菌在苏丹草青贮饲料有氧暴露过程（0、2、3、4和8 d）中的检出比例编号酵母菌种类0 d2 d4 d6 d8 dCKLPLRLBCKLPLRLBCKLPLRLBCKLPLRLBCKLPLRLB1Z. bailii21.416.8NdNd30.926.321.5Nd42.635.435.323.252.445.343.430.860.951.746.737.22C. tropicalis18.7NdNdNd30.22.7NdNd25.38.9Nd11.321.110.2Nd24.314.811.3Nd25.93C. ethanolica30.3NdNdNdNd6.326.936.82.49.918.730.35.511.715.321.92.912.48.318.64C. rugosaNdNdNdNd1.212.5Nd63.210.515.312.335.219.820.315.12320.320.926.418.35C. glabrataNdNdNdNdNdNdNdNdNdNdNdNdNdNdNdNdNdNd5.2Nd6C. quercitrusaNd83.2NdNdNd52.2NdNdNd30.55.4NdNd12.36.7NdNd1.52.7Nd7K. marxianusNdNdNdNd22.5Nd51.6Nd16.6Nd28.3Nd0.6Nd19.5NdNd0.98.9Nd8S. cerevisiae29.6NdNdNd15.2NdNdNd2.6NdNdNd0.60.2NdNd0.30.81.8Nd9P. kudriavzeviiNdNdNdNdNdNdNdNdNdNdNdNdNdNdNdNd0.80.5NdNd注：Nd表示未检测到。%由表4可知，随着有氧暴露时间的延长，各处理组苏丹草青贮饲料的pH值均逐渐升高。CK组苏丹草青贮饲料的酵母菌起始数量较多，随着有氧暴露时间的进行，其酵母菌数量的增加速度较快。0~8 d内，所有处理组苏丹草青贮饲料的酵母菌数量和pH值均同步上升。0 d时，LB组苏丹草青贮饲料的酵母菌数量较少（≤2.4 lgCFU/g FM），随着有氧暴露时间的延长，其酵母菌的数量不断增加，但增加的较为缓慢。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.027.T004表4苏丹草青贮饲料有氧暴露过程中的pH值及酵母菌数量有氧暴露天数/d项目CK组LP组LR组LB组0pH值4.57a4.16c4.24b4.32b酵母菌/（lgCFU/g FM）4.03a3.29b2.42c2.04d2pH值4.69a4.44b4.45b4.45b酵母菌/（lgCFU/g FM）4.26a3.67b3.23c2.53d4pH值4.72a4.51c4.61b4.51c酵母菌/（lgCFU/g FM）4.37a4.12b3.88c2.91d6pH值5.15a4.93b4.73c4.62c酵母菌/（lgCFU/g FM）4.48b4.23c4.78a3.42d8pH值5.23a5.02b4.79c4.70c酵母菌/（lgCFU/g FM）4.53b4.54b5.05a3.64c3讨论3.1同/异质型乳酸菌对苏丹草青贮饲料发酵品质的影响同/异质型乳酸菌的添加均可显著提高青贮饲料的发酵品质。高瑞红等[12]研究发现，与对照相比，乳酸菌接种后的玉米青贮饲料乳酸含量高，氨态氮含量低。王媛等[13]研究发现，与对照相比，添加乳酸菌后的苜蓿青贮饲料pH值显著降低。Zhang等[14]在羊草青贮饲料添加植物乳杆菌（L. plantarum）和干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），发现与对照相比，添加乳酸菌的羊草青贮饲料乳酸含量更高，pH值和丁酸含量更低。王旭哲等[15]研究发现，单一添加异质型乳酸菌布氏乳杆菌（L. buchneri）可显著改善玉米的青贮品质，提高开窖后的有氧稳定性。近年来，已有相关研究将鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus）作为青贮饲料添加剂，但对不同种类牧草和不同菌株的添加效果不同。Guan等[16]研究发现，接种鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus）对青贮发酵产物和微生物群落的影响很小，但是可以抑制不良微生物的发酵。Gulfam等[17]研究表明，在30 ℃的环境下，接种鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus）的象草乳酸含量达17.4 mg/g DM。本研究中，所使用的植物乳杆菌（L. plantarum）和鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus）为同质型发酵乳酸菌。虽然有研究报道鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus）在50℃以下时为同型发酵，50℃以上时为异型发酵[17]，但该结果仍需更多的研究予以论证。布氏乳杆菌为异质型发酵乳酸菌，与对照相比，添加乳酸菌后苏丹草青贮饲料的乳酸含量显著增加，pH值、丁酸和氨态氮含量显著降低，LB组的乙酸含量显著（P0.05）高于LP组和LR组，添加乳酸菌组的青贮饲料发酵品质均提高，这与上述试验结果一致。3.2同/异质型乳酸菌对苏丹草青贮饲料有氧稳定性的影响同/异质型乳酸菌在青贮发酵过程中的主要产物均为乳酸，但异质型乳酸菌在青贮发酵过程中会产生一定的乙酸[18-20]。Kung[2]提出青贮饲料在有氧变质过程中有多米诺骨牌效应，当青贮饲料开装后直接暴露于空气中时，在青贮发酵过程中受到抑制的酵母菌等得以重新被激活，这些微生物可利用青贮发酵过程中产生的乳酸或青贮饲料中剩余的可溶性糖，将其转变为水和二氧化碳，释放大量的热，引起青贮饲料内部pH值升高，此过程会使小范围内的青贮饲料发生腐败变质；青贮饲料pH值的不断升高又会进一步激活其他受抑制的霉菌和有氧细菌，从而造成更大面积的青贮饲料腐败。青贮饲料的有氧稳定性会受到饲料原料及添加剂等多种因素的影响[20]。Filya[21]以布氏乳杆菌（L. buchneri）和植物乳杆菌（L. plantarum）为外源添加剂，探讨其对不同种类青贮玉米的有氧稳定性，发现添加布氏乳杆菌（L. buchneri）处理青贮饲料的有氧稳定时间在80~181 h，而添加植物乳杆菌（L. plantarum）处理的青贮饲料有氧稳定时间仅为26~31 h，二者差异显著。在有氧暴露阶段，布氏乳杆菌（L. buchneri）通过将乳酸转化为乙酸和1，2-丙二醇来增加其有氧稳定性，而植物乳杆菌（L. plantarum）处理的青贮饲料在有氧暴露初期乙酸含量较少，对有害微生物的限制作用有限。Wambacq等[22]研究表明，布氏乳杆菌（L. buchneri）能有效抑制青贮过程中酵母菌等真菌的生长，改善青贮发酵的有氧稳定性。本试验研究结果与上述研究结果相一致，与对照相比，添加异质型乳酸菌布氏乳杆菌（L. buchneri）后可明显提高苏丹草青贮饲料的有氧稳定时间。3.3同/异质型乳酸菌对苏丹草青贮饲料有氧暴露过程中酵母菌群落的影响在青贮制作过程中添加乳酸菌能够改善饲料的青贮品质[1]。同质型发酵乳酸菌作为添加剂使用后可迅速降低青贮饲料的pH值，但同质性乳酸菌的主要代谢产物为乳酸，产生的乙酸等挥发性脂肪酸含量较低，对酵母菌和霉菌等的抑制作用有限，在贮藏和取用过程中更容易发生腐败[23-24]；异质型乳酸菌能够提高青贮饲料中的乙酸含量并提高其有氧稳定性[21]。本研究中，随着有氧暴露时间的延长，各处组苏丹草青贮饲料的pH值均逐渐升高，但异质型乳酸菌处理青贮饲料中的酵母菌增长速率明显低于同质型乳酸菌处理。有氧稳定时间最长的LB处理，其酵母菌的种类最少，仅有拜氏接合酵母（Z. bailii），热带假丝酵母（C.t ropicalis），嗜酒假丝酵母（C. ethanolica）和假丝酵母（C.rugosa）4类，明显少于同质型乳酸菌处理。在青贮发酵过程中，酵母菌会与乳酸菌竞争发酵底物，延缓发酵进程，引起青贮饲料的有氧变质[25]。Li等[26]以意大利黑麦草为原料，探讨鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus）和布氏乳杆菌（L. buchneri）对意大利黑麦草青贮饲料中微生物群落的影响，发现添加布氏乳杆菌（L. buchneri）处理的青贮饲料无论是否发生好氧变质，均能检测出克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus），推测克鲁维酵母（K. marxianus）可能是引起青贮饲料好氧变质的主要原因。王慧丽[9]以全株玉米及其调制的TMR原料为研究对象，在TMR好氧变质过程中只检出了拜氏接合酵母（Z. bailii），推测拜氏接合酵母（Z. bailii）可能是引起TMR好氧变质的主要原因。本研究中，随着有氧暴露天数的延长，所有处理中均出现了拜氏接合酵母（Z. bailii），且比例随着有氧暴露天数的延长不断提高，推测拜氏接合酵母（Z. bailii）可能是引起苏丹草青贮饲料有氧变质过程中的主要酵母菌，该结果仍需更多的试验予以验证。4结论添加同/异质型乳酸菌显著提高苏丹草青贮饲料的发酵品质，LP组V-score评分最高。添加布氏乳杆菌（L. buchneri）对提高苏丹草青贮饲料有氧稳定性的效果最好，其有氧稳定时间达到了159 h。拜氏接合酵母（Z. bailii）可能是引起苏丹草青贮饲料有氧变质的主要酵母菌。