脂肪肝出血综合征（fatty liver hemorrhagic syndrome，FLHS）是危害蛋鸡养殖业的主要营养代谢性疾病之一，主要以脂代谢紊乱为特征。FLHS因患病临床表现不明显、呈散发性，在生产中不易被及早发现并治疗。目前，临床上对FLHS的防控主要以预防为主，缺乏专用治疗药物和完善的防治机制[1-3]。鸡骨草（Abrus cantoniensis Hance，ACH）为广州相思子植物的干燥全株。鸡骨草主要化学成分包括黄酮类、多糖类、三萜类等。鸡骨草具有分布广、价格低廉等优点[4-6]。鸡骨草具有清热解毒、利湿退黄、疏肝止痛之功效。近年来，鸡骨草在降低血浆和肝脏中脂质含量、促进脂质代谢及改善肝组织结构等方面的作用已得到充分证实。鸡骨草提取物对FLHS的影响少见报道。本试验通过饲喂蛋鸡高脂低蛋白饲料诱导蛋鸡血脂紊乱，同时饮水给予不同剂量的鸡骨草提取液，研究鸡骨草提取物对血脂的调控作用，为进一步研发鸡骨草防治蛋鸡脂肪肝综合征的中药制剂提供参考。1材料与方法1.1鸡骨草提取物的制备鸡骨草干燥全株（采自广西玉林）干燥后切断，10倍体积水浸泡1 h，煎煮2 h，分离滤液，5倍体积水煎煮1 h，将2次滤液合并，浓缩至原生药浓度3 g/mL，分装，4 ℃保存备用。1.2试验设计根据文献报道方法诱导FLSH模型[7-8]。蛋鸡基础日粮为普通全价饲料，高脂低蛋白饲料在基础日粮基础上将玉米含量提高6%，麦麸含量降低0.8%，豆粕含量降低9.42%，加入4.22%的大豆油。试验日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.010.T001表1试验日粮组成及营养水平项目基础日粮高能低蛋白日粮原料组成/%玉米64.0070.00麦麸2.001.20豆粕24.0014.58大豆油0.004.22钙8.008.00预混料2.002.00合计100.00100.00营养水平代谢能/(MJ/kg)11.2513.02粗蛋白/%15.8612.00有效磷/%0.510.46精氨酸/%1.030.74蛋氨酸/%0.370.32缬氨酸/%0.770.58蛋氨酸+半胱氨酸/%0.670.56注：预混料为每千克日粮提供：铜2.5 mg、铁20 mg、锰15 mg、锌17.5 mg、碘4 mg、亚硒酸钠6 mg、氯化钴2.5 mg、蛋氨酸50 mg、吡啶铬2.00 mg、多维15.00 mg、植酸酶10.00 mg、激肽酶7.50 mg、抗氧化剂2 mg、胆碱50.00 mg、盐200 mg、磷钙500 mg、沸石粉76 mg。选取60只90日龄京粉蛋鸡，随机分为对照组、模型组和3个剂量鸡骨草处理组（低、中、高），每组12只，空白对照组每天饲喂蛋鸡普通基础全价饲料；模型组每天饲喂高能低蛋白饲料；低剂量组（LACH）每天饲喂高脂饲料＋0.5 g/只鸡骨草提取液；中剂量组（MACH）每天饲喂高脂饲料＋1 g/只鸡骨草提取液；高剂量组（HACH）每天饲喂高脂饲料＋2 g/只鸡骨草提取液。ACH提取液每天饮水给药1次。蛋鸡分笼饲养于清洁笼架上，自由采食、饮水，舍内相对湿度40%~50%，温度（23±2）℃，光照时间15 h/d，试验期48 d。1.3仪器与试剂BC-5140全自动动物血常规分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；DP8018-VET动物版全自动生化分析仪（广州东唐电子科技有限公司）。血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）检测试剂盒均购自上海江莱生物科技有限公司。1.4样品采集试验第48 d，禁食12 h，所有试验鸡心脏采血，部分血液抗凝，用于血常规指标检测；部分血液静止凝血，1 500 r/min离心10 min，分离血清，-20 ℃保存，用于血脂指标检测。采集肝脏，修剪后固定于10%福尔马林溶液中，固定液隔天更换1次，固定组织用于石蜡切片。1.5测定指标及方法1.5.1血常规和血脂指标利用BC-5140全自动血常规分析仪进行血常规指标的测定[9]，检测指标包括白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、血细胞比容（HCT）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）和红细胞分布宽度(RDW)。参照试剂盒说明书测定总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HLD-C）和低密度脂蛋白（LDL-C）的含量。1.5.2肝脏组织病理学观察取固定好的肝脏组织，常规方法进行石蜡包埋，切片后进行苏木素——伊红染色，封片后采用数字图像采集系统采集图像，观察肝脏病理学变化。1.6数据统计与分析数据采用SPSS 24.0统计软件进行统计分析（t检验），结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1临床症状及病理变化试验期间观察蛋鸡临床表现发现，试验20 d后，模型组部分蛋鸡出现不同程度的食欲减退、喜卧、嗜睡、跛行、鸡冠轻度褪色，甚至有蛋鸡死亡。剖检后发现，蛋鸡肝脏颜色变浅，呈土黄色，甚至破裂。试验结束时，模型组鸡剖检后均观察到肝脏色黄、肿大、质脆易碎、触之有油腻感；腹部和肠系膜蓄积大量的脂肪；肠管、肝脏、心脏及肌胃表面也有脂肪沉积和出血点。空白对照组鸡剖检正常，不同剂量的ACH组蛋鸡肝脏颜色浅于阴性对照组，但深于模型组，LACH组的大体病理变化严重程度均大于MACH和HACH组，但MACH和HACH之间的病理变化不显著。2.2鸡骨草提取液对蛋鸡血液常规指标的影响（见表2）由表2可知，模型组血常规各项指标与对照组无显著差异（P0.05）；相比模型组，LACH组蛋鸡MCV显著降低（P0.05），其余指标无显著差异（P0.05）；相比于对照组和模型组，MACH组蛋鸡RBC数量显著升高（P0.05）。与模型组相比，HACH组蛋鸡WBC数量显著增高（P0.05），其余指标无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.010.T002表2鸡骨草提取液对蛋鸡血液常规指标的影响项目对照组模型组LACH组MACH组HACH组WBC/(×109/L)387.47±2.97ab385.57±1.57b382.73±5.26b386.70±6.90ab391.88±4.98aRBC/(×1012/L)2.22±0.12b2.24±0.14b2.35±0.18ab2.50±0.08a2.29±0.17bHGB/(g/L)76.20±2.0274.43±2.8976.73±2.5875.90±2.5576.17±2.26HCT/%27.43±4.4125.32±1.4926.67±2.3626.40±2.0725.38±1.06MCV/fL114.69±0.89ab116.37±1.20a113.69±2.10b114.96±1.50ab115.29±1.76abMCH/pg30.55±0.8730.15±0.5730.20±0.5429.97±0.6530.13±0.77MCHC/(g/L)287.03±2.92287.70±2.56285.98±7.19286.97±1.74285.98±1.78RDW/%38.92±1.2438.74±1.0339.11±0.7138.40±1.1638.21±1.05注：同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著（P0.05），不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01）；下表同。2.3鸡骨草提取液对蛋鸡血脂的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，模型组TC、TG、LDL-C含量均显著升高，HDL-C含量显著降低（P0.05）；LACH组各项血脂指标与模型组相比差异均不显著（P0.05）；相比模型组，在MACH组中，TC、TG和LDL-C含量均显著降低，HDL-C水平显著升高（P0.05）；HACH组中TC、TG和LDL-C含量均显著低于模型组，HDL-C含量显著高于模型组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.010.T003表3鸡骨草提取液对蛋鸡血脂的影响项目对照组模型组LACH组MACH组HACH组TC/(mmol/L)33.60±3.86c59.80±6.05a59.10±6.10a47.00±6.97c37.80±7.81bTG/(mmol/L)2.35±0.49d5.02±0.55a5.05±0.42a3.63±0.64c2.96±0.56bHDL-C/(µmol/L)1 210±192a742±68c840±120bc870±91a1 150±146bLDL-C/(mmol/L)5.76±0.51c8.89±0.88a8.70±0.72a7.62±0.56c6.88±0.72b2.4鸡骨草提取液对蛋鸡肝脏的影响（见图1）由图1可知，空白对照组试验鸡肝脏细胞结构完整、界限清楚、胞质均匀；模型组试验鸡肝组织结构紊乱、有较多的空泡存在于肝细胞内、肝索间隙变大、结构模糊；LACH组试验鸡肝组织结构紊乱、肝细胞内存在少量较小的空泡变性；MACH组和HACH组试验鸡肝组织结构清晰、肝细胞结构完整、未见明显空泡变性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.010.F001图1肝脏HE染色3讨论3.1高能低蛋白饲料对蛋鸡血脂的影响饲料中养分不均衡，能量过剩、蛋白质含量低及微量元素不足，可导致蛋鸡体内脂质代谢发生紊乱，引起血脂水平升高、肝细胞变性，进一步则导致脂肪肝的形成。本试验中，采用饲喂高能低蛋白饲粮来诱导血脂代谢障碍的发生。因为临床上FLHS主要以脂代谢紊乱为特征，而高能低蛋白的饲粮会导致血浆中脂肪酸增加，未被动物利用的碳水化合物在体内转化为脂肪蓄积（主要是TG），蓄积在体内的脂肪会由于蛋白质含量不足缺乏载脂蛋白而难以排出，由此引发脂肪代谢障碍。笼养技术使蛋鸡运动量减少，机体能量消耗下降，更容易促进蛋鸡脂肪肝综合征的发生[7-8,10-11]。Peng等[12]和Rozenboim等[13]研究表明，高能低蛋白饲料会导致FLSH的发生。本试验模型组蛋鸡出现食欲下降、嗜睡、喜卧、跛行、鸡冠褪色等临床表现，结合血液生化指标和病理组织学结果，提示造模成功。3.2鸡骨草提取液对蛋鸡血常规的影响血常规是评价动物健康的重要依据。目前，还没有关于饲喂高能低蛋白饲料对蛋鸡血常规影响的相关报道。本试验中，模型组与对照组蛋鸡血常规各项指标差异均不显著，表明饲喂高脂饲料对蛋鸡血常规各项指标影响不大。鸡骨草提取液在降脂保肝作用方面大部分研究都集中在血脂、胆固醇等血清生化指标的研究上[14]。陈晓白等[15]研究表明，ACH提取液能够降低高血脂模型大鼠的平均红细胞体积（MCV）和血流速度，推测该影响也会发生在蛋鸡FLSH形成过程中。3个剂量的ACH处理中，HACH组WBC含量显著高于模型组，MACH组RBC含量显著高于模型组，LACH组MCV显著低于模型组，3个剂量组与模型组其余血常规各项指标差异均不显著，说明ACH提取液对FLSH蛋鸡血常规未见显著影响。3.3鸡骨草提取液对蛋鸡血脂的影响ACH含有黄酮类、生物碱类、三萜类、蒽醌类、多糖类等多种化学成分，相思子碱和下箴刺桐碱是主要生物碱类物质，夏佛塔苷和新西兰牡荆苷2为主要黄酮碳苷。药理活性研究发现ACH具有降血脂、抗氧化和保肝护肝的作用，其降脂保肝作用与其总黄酮活性成分有关[16]，总黄酮能及时清除体内堆积的氧自由基，具有抗氧化能力[17-19]。因此，推测ACH降脂保肝作用可能与抗氧化机制有关[6,20-21]。袁旭江等[22]在ACH降脂保肝有效成分分子对接筛选的试验研究中发现，ACH的有效成分能够通过游离状态进入血液而发挥药效。本试验血液生化指标检测结果显示，与对照组相比，模型组醇TC、TG和LDL-C含量显著升高，HDL-C含量显著降低，与文献[8,12,23]相符。高中低3个剂量处理组中，除HDL-C外，其余血脂指标差异均显著。中、高剂量ACH提取液对蛋鸡FLSH血脂四项指标影响较大，且各项指标更趋近于对照组，与文献[24]结果相符，说明ACH对大鼠血脂的调节作用同样适用于蛋鸡。雷清瑶[24]在ACH提取物对非酒精性脂肪肝（NAFLD）大鼠肝组织相关激酶ROCK、CD14表达水平的影响观察试验结果中发现，ACH提取物能降低激酶ROCK、CD14的含量，在一定程度上对肝组织有保护作用。因此，推测ACH可能通过肝组织相关激酶对蛋鸡肝组织进行保护。本试验未针对ACH降血脂作用机制进行研究，在后期研究中应结合蛋鸡脂质代谢特征进一步明确ACH的有效作用物质和作用途径。4结论ACH提取液对高能低蛋白饲料饲喂蛋鸡血液常规各项指标未见显著影响。ACH提取物中、高剂量组能够提高蛋鸡HDL-C含量，降低TC、TG和LDL-C含量，消除高能低蛋白饲料引起的肝细胞空泡变性，ACH提取液中剂量组效果优于高剂量组，提示ACH提取液（2 g/只）对蛋鸡FLSH具有较好的治疗效果。本试验在一定程度上为ACH的临床利用及治疗蛋鸡FLSH作用机制提供参考。