随着无抗时代的到来，饲料添加剂中的促生长类药物（除中药类）全面停产[1]。我国的微生态制剂和酶制剂的产量正在持续快速的增长[2]，寻找优质的微生态制剂菌种和更优质的酶制剂对养殖业和饲料行业发展具有重要作用。枯草芽孢杆菌在工业生产和应用中是公认安全的菌种，对动物和人体有益[3]。枯草芽孢杆菌在营养匮乏时产生抗逆性芽孢，可以在酸碱、高温、辐射等不利环境中存活一定时间[4-5]。枯草芽孢杆菌有助于稳定肠道环境，可拮抗肠道中有害菌群的附着增殖，增进饲料中营养吸收[6]，已被应用于家禽家畜和水产养殖等行业[7]。β-甘露聚糖酶（β-1,4-D-mannan mannanohydrolases，EC.3.2.l.78）能够水解甘露聚糖类中β-1, 4-甘露糖苷键生成甘露寡糖（mannan-oligosaccharide，MOS）[8]。MOS能够刺激肠道有益菌群Lactobacillus、Bifidobacterium等的增殖，抑制Escherichia coli、Salmonella等病原微生物在肠道壁上的定植[9]，通过抗原特性激活免疫应答，促进血清免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）等免疫蛋白表达水平，对动物体的健康和生长均有益处[10-12]。β-甘露聚糖酶酶制剂面临着生产、储藏时的降解，在动物体内被酸、蛋白酶降解等问题，对酶的稳定性、耐酸性、耐热性和抗蛋白酶性质都有着较高的要求。利用芽孢的抗逆性，使菌株在动物肠道内产酶能有效避免发挥效力前的降解问题。本研究旨在寻找能产耐高温且稳定性良好的β-甘露聚糖酶芽孢杆菌，为微生态制剂发展提供优质的β-甘露聚糖酶产生菌株。1材料与方法1.1材料与仪器土壤样品采自河北安国市半夏根部土壤。魔芋胶、DNS试剂、刚果红染料、D-甘露糖、250 N.F.U/mg胰蛋白酶、HiFi Taq酶。DH6000电热恒温培养箱（河北泰斯特仪器有限公司）、ZWY-2102C振荡摇床（上海智诚分析仪器制造有限公司）、FA1004N分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）、HH-2型数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）、My Cycler PCR仪和凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）、SpectraMaxm i3x多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）。1.2试验方法1.2.1产β-甘露聚糖酶菌种的分离及初筛取半夏根部土样，悬于无菌水后按文献[13]方法进行富集培养及筛选培养，在待菌落长成合适大小后，观察菌落形态，挑取不同特征的菌落点种到4孔筛选平板，培养24 h，采用刚果红染色法筛选水解圈直径（D）与菌落直径（d）之比（D/d）较大的菌株，连续2次培养和刚果红染色以纯化菌株。1.2.2菌种鉴定参照文献[14]测定菌株的生理生化指标。参照文献[15]提取菌种基因组DNA。以基因组DNA为模板，16S rDNA通用引物，使用HiFi Taq扩增16S rDNA片段。PCR产物测序完成后，在GenBank中比对序列，选取同源性序列，使用MEGA 6.0构建系统发育树[16-18]。1.2.3β-甘露聚糖酶酶学性质研究参考文献[13]测定菌株β-甘露聚糖酶的酶学性质。1.2.3.1粗酶液的制备挑取BS1、BS2单克隆至LB培养基，在37 ℃、180 r/min过夜振荡培养，以10%接种量转接至盛有45 mL发酵培养基（魔芋胶5 g/L、蛋白胨5 g/L、KH2PO4 1 g/L、MgSO4 0.1 g/L）的250 mL三角瓶中，同样条件继续培养1~9 d。发酵液12 000 r/min离心10 min，上清液稀释后用于测定酶活性。1.2.3.2D-甘露糖标准曲线的制定按文献[13]方法进行标准曲线制定。1.2.3.3β-甘露聚糖酶活性测定底物为0.5%魔芋胶，溶于0.1 mol/L、pH值6.0磷酸盐缓冲液中。270 µL底物与30 µL稀释酶液混匀，最适温度下孵育10 min，加入600 µL DNS试剂，混匀，沸水浴5 min，流水冷却至室温，取180 µL至96孔板，在SpectraMaxm i3x酶标仪上测定OD540 nm。底物与稀释的粗酶液混匀，立即与DNS混匀、煮沸及冷却后为空白对照。每组粗酶液做3次重复。酶活性定义参照文献[19]。1.2.3.4温度对酶活性的影响取稀释后的酶液与底物混合，在30~90 ℃分别孵育10 min，然后按1.2.3.3的方法测定β-甘露聚糖酶活性。相对酶活性计算方法参考文献[13]，以下同。1.2.3.5酶的热稳定性适当稀释酶液后，在40~80 ℃内，间隔10 ℃孵育30 min，测定样品残余酶活性。1.2.3.6pH值对酶稳定性的影响配制0.1 mol/L不同pH值的酸碱缓冲液（pH值3.0~12.0）[20]，与酶稀释液等体积混合，37 ℃孵育1 h，测定残余酶活性。1.2.3.7金属离子对酶活性的影响配制不同浓度（10 mmol/L和20 mmol/L）Ca2+、Zn2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、K+、Na+，与酶稀释液等体积混匀，37 ℃孵育1 h，测定酶活性。金属离子影响下的相对酶活性为：特定金属离子影响的残余酶活性/稀释相同倍数的酶稀释液酶活性×100%。1.2.3.8发酵时间对酶活性的影响分别取发酵后1~9 d的粗酶液，测定随发酵时间变化的样品酶活性。不同发酵时间的相对酶活性为：特定发酵时间酶活性/发酵最高酶活性×100%。1.2.3.9胰蛋白酶消化对酶活性的影响取发酵的粗酶液和市售商品酶A，分别适当稀释后与10 mg/mL的胰蛋白酶等体积混合，酶液与水混合作为对照，37 ℃孵育1 h后，测定3种β-甘露聚糖酶残余酶活性。计算不同酶液被胰蛋白酶消化后的相对酶活性，即胰蛋白酶消化的酶液酶活性/胰蛋白酶未消化的酶液酶活性×100%。1.3枯草芽孢杆菌产芽孢能力测定挑取单克隆，在种子培养基中37 ℃、180 r/min培养15~16 h，以2%转接量转接到产芽孢培养基[21]，培养48 h，结晶紫染色后显微镜下观察芽孢形态。将适当稀释菌液置于80 ℃水浴20 min，涂布于LB固体培养基培养，以不做高温处理相同稀释度的菌液为对照，待菌落长出后计算产孢率。1.4数据统计与分析酶学性质研究试验进行3次重复，空白对照均为未在最适温度下孵育即刻与DNS混合煮沸处理，依据酶活性的平均值和标准误，采用Origin 2017对数据进行处理。2结果与分析2.1菌株的筛选与分离（见图1）由图1可知，利用魔芋胶作为碳源和诱导物，利用刚果红染色法，筛选出较大透明圈的两株菌分别命名为BS1和BS2。BS1和BS2菌株在LB固体培养基中培养不同时间，12 h后BS1形成的菌落成白色、表面较干燥，继续培养8 h及更长时间菌落变成褐色（图1a）；BS2菌落白色、表面湿润、黏稠不易挑起，培养12 h或更长时间菌落无色素产生，仍呈白色（图1b）。筛选培养基培养20 h，经刚果红染色后得到如图1的透明圈，经计算得出BS1 D/d比值为2.5，BS2 D/d比值为3.5（图1c、图1d）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.017.F001图1分离菌株形态和刚果红染色结果2.2菌株的鉴定结果2.2.1菌株生理生化特征测定结果（见表1）由表1可知，在所测定的生理生化指标方面完全一致，如产酸、革兰氏阳性、产生芽孢、能够水解纤维素和淀粉、还原硝酸盐等。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.017.T001表1BS1/BS2的生理生化特征项目菌株特性项目菌株特征BS1BS2BS1BS2形状++D-木糖产酸++孢子++D-甘露醇产酸++pH值5.7生长++淀粉水解++革兰氏染色++柠檬酸盐利用++接触酶反应++丙酸盐利用--V-P测定++硝酸盐还原++产蛋白酶++酪氨酸分解--D-葡萄糖产酸++纤维素水解++L-阿拉伯糖产酸++注：+表示阳性，-表示阴性。2.2.2菌株的16S rDNA分子发育树（见图2）由图2可知，两种菌株与Bacillus subtilis subsp. Spizizenii NRRL B-23049[CP002905]亲缘关系最近，进化距离为0.000 9。综上将两株菌鉴定为枯草芽孢杆菌，并分别命名为B. subtilis BS1和B. subtilis BS2，16S rDNA的NCBI注册号分别为MW484884和MW484887。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.017.F002图2基于16S rDNA序列构建的系统发育树2.3β-甘露聚糖酶酶学性质2.3.1温度对酶活性的影响（见图3）由图3可知，通过比较不同温度下酶活性的大小，得出BS1和BS2两株菌所产β-甘露聚糖酶ManBS1和ManBS2最适温度为70 ℃（图3a）。在37 ℃时均表现出超过50%的酶活性，ManBS1和ManBS2在40~70 ℃温度范围内有着良好的稳定性，孵育30 min后酶活性能维持在90%以上（图3b）。80 ℃孵育30 min后，ManBS1几近失活，ManBS2的残余酶活性为40%，这表明在耐高温方面，ManBS2性能优于ManBS1。图3温度对酶活性的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.017.F003（a）不同温度下相对酶活性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.017.F004（b）孵育30 min酶的热稳定性2.3.2pH值对酶稳定性的影响（见图4）由图4可知，在经历过1 h的酸碱破坏后，ManBS1在pH值6~11、ManBS2在pH值5~11均保留超过80%的残余酶活性，有利于在中性环境的肠道中发挥效力，但在pH值小于5的酸性环境中容易失活。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.017.F005图4pH值对酶稳定性的影响2.3.3金属离子对酶活性的影响（见图5）由图5可知，金属离子对ManBS1和ManBS2的影响有着一定的差异。Cu2+、Mg2+、Ca2+对ManBS1表现出激活作用，其中10 mmol/L Ca2+提高了12%的酶活性；Mn2+抑制ManBS1的酶活性，使酶活性降低了18%；Zn2+在低浓度（5 mmol/L）下提高了酶活性，但在较高浓度（10 mmol/L）却对酶活性有抑制作用；而一价金属离子K+和 Na+对ManBS1酶活性无明显激活和抑制作用。ManBS2受Ca2+的激活作用明显，提高了8%的酶活性，Mn2+和Zn2+均抑制ManBS2的酶活性，Mn2+使ManBS2酶活性下降超过20%。总的来看，10 mmol/LCa2+均能提高ManBS1和ManBS2的酶活性，且价格低廉，在制备酶制剂时可以适量添加。图5金属离子对酶活性的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.017.F006（a）对ManBS1活性的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.017.F007（b）对ManBS2活性的影响2.3.4发酵时间对酶活性的影响（见图6）由图6可知，两株菌的产酶量随发酵时间延长呈现先升高再下降的趋势，BS1菌株在第7 d酶活性达到最高，为122 U/mL；BS2菌株在发酵第8 d酶活性最高，为97 U/mL。Liu等[22]研究表明，枯草芽孢杆菌YH12在发酵33 h时产酶量达到最高；王梅等[23]报道，枯草芽孢杆菌MSJ-5在32 h酶活达到最高，可能与本研究所使用的培养基较贫瘠有关。由于两株枯草芽孢杆菌均能产蛋白酶，但ManBS1和ManBS2随发酵时间延长产酶量提高，因此推测ManBS1和ManBS2两种酶对蛋白酶有一定的抵抗能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.017.F008图6发酵时间对酶活性的影响2.3.5胰蛋白酶消化对酶活性的影响（见表2）由表2可知，ManBS1和ManBS2经5 mg/mL的胰蛋白酶消化1 h后，仍分别有96%和87%的残余酶活性，而购买的商品酶A仅剩余47%残余酶活性，说明ManBS1和ManBS2两种酶都对胰蛋白酶有着极强的抗消化能力，有利于在动物肠道中发挥稳定的效果。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.017.T002表2胰蛋白酶消化对酶活性的影响β-甘露聚糖酶相对酶活性商品酶A47.1±3.8ManBS195.9±7.3ManBS286.7±4.2%2.4枯草芽孢杆菌产芽孢能力测定经过产芽孢培养，结合镜检和活菌计数观察，两株菌产孢能力存在一定差异，BS1发酵4 d后的活菌量达1.4×109 CFU/mL，产孢率70%；BS2发酵3 d发酵液活菌量1×109 CFU/mL，产孢率95%，这说明BS2更易于产孢。3讨论在饲料添加剂中，有机酸、微生态制剂和酶制剂被越来越多的研究人员认可[24]。β-甘露聚糖酶是农业农村部允许在饲料中添加的酶制剂，酶制剂的酶活力、稳定性及抗胰蛋白酶消化能力是衡量制剂效率的重要指标。枯草芽孢杆菌源性β-甘露聚糖酶最适反应温度多在40~65 ℃[25]，本研究筛选两株菌所产β-甘露聚糖酶ManBS1和ManBS2的最适温度70 ℃，对高温的耐受性优于多数枯草芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌SUW60在60 ℃孵育1 h，酶活性剩余40%[26]。Bacillus nealsonii PN11的β-甘露聚糖酶ManPN11，在目前的报道中热稳定性最好，其最适温度65 ℃，70 ℃孵育30 min残余酶活性小于70%[27]，仍低于本研究的ManBS1和ManBS2在70 ℃的热稳定性。此外，ManBS1、ManBS2对胰蛋白酶表现出了良好的抵抗能力，浓度为5 g/L时残余酶活性分别为96%和87%，比本研究所用的市售某商品酶A抗胰蛋白酶能力提高一倍，也高于部分其他文献报道，如用20 U/mL胰蛋白酶处理来源于Bacillus sublitis TCCC11286的β-甘露聚糖酶2 h，残余酶活性超过60%[28]。胡凤娟等[29]对β-甘露聚糖酶基因进行定点突变，获得Armillariella tabescens的β-甘露聚糖酶抗胰蛋白酶突变体，尽管对胰蛋白酶耐受性提高较大，但仍低于本研究ManBS1和ManBS2的抗胰蛋白酶水解能力。源自Streptomyces sp.S27的β-甘露聚糖酶Man5S27对胰蛋白酶、糜蛋白酶、胶原酶、枯草杆菌蛋白酶和蛋白酶K等几种中性蛋白酶具有高度抗性，酶解处理2 h残余酶活性仍有95%以上[30]，与ManBS1的抗蛋白酶能力相当。微生态制剂常用菌种有芽孢杆菌、双歧杆菌、酵母菌和乳酸菌[31]，在动物饲养中已表现出良好的促生长、防腹泻等功能。万根等[32]给猪仔饲喂2 g/kg枯草芽孢杆菌微生态制剂后，猪仔的日增重显著增加、料重和腹泻率都显著下降。薛云等[33]补充0.2%的枯草芽孢杆菌喂养断奶仔兔后，仔兔腹泻和死亡比例显著降低。微生态制剂制备时保持菌的活力是非常关键的环节。芽孢因其良好的抗逆能力和菌活力常被诱导制作益生菌微生态制剂。因此，枯草芽孢杆菌微生态制剂对活菌数和产孢率指标要求较高。本研究分离到的两株枯草芽孢杆菌BS1和BS2，芽孢产量均超过70%，BS2菌株短时间发酵产孢率可达95%，适宜制备微生态制剂。可进一步优化试验条件提高其活菌数和产孢率，如对Bacillus subtilis NHS1菌株采用响应面法优化培养基，产芽孢量提高1.5倍[34]，优化后的Bacillus subtilis SR096芽孢产量显著提高[35]。饲料的菌酶协同作用是发酵饲料和酶解饲料基础上的组合，微生物和酶的联合作用能对饲料中的多聚糖和抗营养因子等大分子生物质更有效的分解，但目前对基质菌种和酶的合理搭配上还缺乏试验数据的支撑[36]，动物体内的菌酶协同作用相较于单一的酶制剂或微生态制剂对动物的生产性能也有所提高[37]。4结论本试验从土壤中分离到两株产β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌BS1和BS2；两株菌分泌的β-甘露聚糖酶ManBS1和ManBS2在70 ℃能发挥最好的效力，具有良好的热稳定性、pH值稳定性和抗胰蛋白酶分解的性质，Ca2+对ManBS1和ManBS2有激活作用，而Mn2+对两种酶有着较明显的抑制作用。BS1和BS2的产孢率分别为70%和95%，BS2更适合制作微生态制剂产品。