2020年起，我国禁止在饲料中添加抗生素[1]。益生菌是替代抗生素的一种有效手段[2-3]。常用的益生菌有乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌等。乳酸菌是一类能通过发酵糖类产生乳酸的革兰氏阳性细菌，具有调节肠道功能紊乱和维系内源微生态系统平衡的生理功能[4-6]。乳酸菌中的屎肠球菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌等抗逆性较差、不耐热，在加工过程容易损失[7-9]。凝结芽孢杆菌是一类抗逆性强[10-11]、可以利用戊糖和己糖产乳酸[12]的芽孢杆菌。在肠道中，凝结芽孢杆菌能提高蛋白消化率[13]，抑制幽门螺杆菌[14]，促进产蛋母鸡的盲肠微生物合成α-茄碱、抑制病原体和癌细胞的生长[15]，具有良好的益生特性。因此，选取凝结芽孢杆菌作为益生菌添加剂可以达到一般乳酸菌调节肠道功能的效果，还能够有效解决一般乳酸菌在加工过程中容易损失的缺点[16-19]。本试验探索1株凝结芽孢杆菌N1的抗逆性、抗生素敏感性等特性，并通过单因素试验和正交试验优化发酵条件，为该菌株作为益生菌的生产应用提供参考依据。1材料与方法1.1材料与试剂凝结芽孢杆菌N1为本实验室筛选分离得到。MRS培养基、哥伦比亚血平板均购自广东环凯微生物科技有限公司。模拟胃液：胰蛋白胨8.3 g/L、葡萄糖3.5 g/L、NaCl 2.05 g/L、CaCl2 0.11 g/L、KCl 0.37 g/L、KH2PO4 0.6 g/L、猪胆盐0.05 g/L、溶菌酶0.1 g/L、胃蛋白酶13.3 g/L，用盐酸调节pH值至2.5。1.2仪器与设备H1650离心机（长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司）、UV-1800紫外分光度计（SHIMADZU（CHINA）CO.，Ltd）、AIRTECH SW-CJ-1F超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、HZ2410-KB-2摇床（太仓市华利达实验设备有限公司）、BXM-30R高压灭菌锅（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、DNP-9052恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）。1.3试验方法1.3.1菌种活化将保存的菌株划线接种到MRS培养基斜面，37 ℃厌氧培养24 h。1.3.2种子液制备挑取活化后的单菌落2环接种到MRS培养基，37 ℃、200 r/min培养24 h。1.3.3发酵液制备将种子液接种到MRS培养基，接种量为5%，37 ℃、200 r/min培养24 h，用于后续特性研究。1.3.4耐温试验参照文献[20]，取发酵液分别在25、80、90、100 ℃条件下保温处理10 min，以25 ℃处理发酵液为对照组，对各组菌液进行梯度稀释，均匀涂布到MRS培养基，37 ℃厌氧培养48 h后计数。1.3.5耐模拟胃液试验参照文献[21-22]，取发酵液1 mL，加入9 mL模拟胃液处理2 h，取1 mL菌液加入9 mL生理盐水处理2 h作为对照组，对两组发酵液进行梯度稀释，均匀涂布到MRS培养基，37 ℃厌氧培养48 h后计数。1.3.6耐胆盐试验参照文献[21-22]，取发酵液1 mL，加入9 mL 0.3%胆盐溶液处理2 h，取1 mL菌液加入9 mL生理盐水处理2 h作为对照组，对两组发酵液进行梯度稀释，均匀涂布到MRS培养基，37 ℃厌氧培养48 h后计数。1.3.7抗生素敏感试验参照文献[23]，将发酵液用已灭菌的MRS培养基稀释为OD值为0.150的菌液，再用棉签均匀涂布到20 mL LB培养基，等距贴上3个药物敏感测试滤纸片，37 ℃厌氧培养24 h，测定抑菌圈直径。1.3.8微生物溶血试验参照文献[24]，将发酵液划线接种到哥伦比亚血平板，37 ℃厌氧培养24 h，观察有无溶血现象。1.4发酵条件探索参照文献[25-26]，为探索凝结芽孢杆菌N1的产芽孢发酵条件，进行单因素试验和正交试验。1.4.1单因素试验以MRS培养基作为发酵培养基，培养基经过灭菌后，在无菌条件下调节培养基pH值（5.5、6.0、6.5、7.0），接种一定量（3%、5%、7%、9%）的种子液，在各温度条件下（30、35、40、45 ℃）培养一定时间（12、24、36、48 h）后，取一定量的发酵液，在80 ℃水浴处理10 min，进行稀释梯度后均匀涂布到MRS培养基，37 ℃厌氧培养48 h后计数。单因素试验因素水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.018.T001表1单因素试验因素水平水平A发酵时间/hB初始pH值C接种量/%D温度/℃1125.53302246.05353366.57404487.09451.4.2正交试验根据单因素试验结果，以发酵时间、初始pH值、接种量和温度为影响因素进行L9（34）的正交试验，各组取一定量的发酵液，在80 ℃水浴处理10 min，进行稀释梯度后均匀涂布到MRS培养基，37 ℃厌氧培养48 h后计数。L9（34）正交试验各因素水平见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.018.T002表2L9（34）正交试验因素水平水平A发酵时间/hB初始pH值C接种量/%D温度/℃1186.05372246.56403307.07431.4.3验证试验根据正交试验结果确定最优的发酵条件，使用该条件进行发酵，将结果与正交试验中的最优结果进行比较。1.5数据统计与分析试验数据采用SPSS 22.0进行数据处理，采用General linear model进行分析，以LSD法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1凝结芽孢杆菌N1特性2.1.1凝结芽孢杆菌N1的耐温性能（见表3）由表3可知，凝结芽孢杆菌N1的耐温性能较好，经过80 ℃处理存活率为99.5%，90 ℃处理存活率为88.0%，100 ℃处理后存活率仍有81.2%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.018.T003表3凝结芽孢杆菌N1的耐温性能组别活菌数/（×108 CFU/mL）存活率/%对照3.94±0.1610080 ℃3.92±0.1299.590 ℃3.47±0.1188.0100 ℃3.20±0.1981.22.1.2凝结芽孢杆菌N1的耐模拟胃液性能（见表4）由表4可知，该菌株在经过模拟胃液处理2 h后，存活率为72.7%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.018.T004表4凝结芽孢杆菌N1的耐模拟胃液性能组别活菌数/（×108 CFU/mL）存活率/%对照3.93±0.14100模拟胃液2.85±0.2172.72.1.3凝结芽孢杆菌N1的耐胆盐性能（见表5）由表5可知，凝结芽孢杆菌N1在0.3%胆盐环境下能维持极高的存活率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.018.T005表5凝结芽孢杆菌N1的耐胆盐性能组别活菌数/（×108 CFU/mL）存活率/%对照3.57±0.201000.3%胆盐3.46±0.2196.92.1.4凝结芽孢杆菌N1的抗生素敏感性（见表6）由表6可知，凝结芽孢杆菌N1对庆大霉素、氯霉素、环丙沙星、红霉素、丁胺卡那、头孢唑林、氨苄西林和青霉素敏感；对复方新诺明、诺氟沙星具有耐受性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.018.T006表6凝结芽孢杆菌N1的抗生素敏感性抗生素纸片含量抑菌圈直径/mm判定结果庆大霉素10 μg/片41.06±1.91S氯霉素30 μg/片33.73±1.80S复方新诺明23.75/1.25 μg/片2.93±0.37R环丙沙星5 μg/片37.97±1.64S诺氟沙星10 μg/片11.27±0.61R红霉素15 μg/片26.90±1.44S丁胺卡那30 μg/片42.11±1.85S头孢唑林30 μg/片57.31±2.52S氨苄西林10 μg/片32.32±1.17S青霉素10 U/片51.42±2.23S注：S表示对该抗生素敏感；R表示该抗生素不敏感。2.1.5凝结芽孢杆菌N1溶血试验（见图1）由图1可知，凝结芽孢杆菌N1不具有溶血活性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.018.F001图1凝结芽孢杆菌N1溶血试验2.2发酵条件优化2.2.1发酵时间对芽孢数的影响（见图2）由图2可知，芽孢数在12~24 h增长，在24 h后基本稳定，因此选取18、24、30 h作为正交试验的发酵时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.018.F002图2发酵时间对芽孢数的影响2.2.2培养基初始pH值对芽孢数的影响（见图3）由图3可知，芽孢数在pH值6.5时达到最大，选取pH值6.0、6.5、7.0作为正交试验的初始pH值。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.018.F003图3培养基初始pH值对芽孢数的影响2.2.3接种量对芽孢数的影响（见图4）由图4可知，芽孢数在接种量为7%时达到最高，与接种量5%时相近，选取接种量5%、6%、7%作为正交试验的接种量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.018.F004图4接种量对芽孢数的影响2.2.4温度对芽孢数的影响（见图5）由图5可知，芽孢数在温度为40 ℃时达到最高，选取发酵温度37、40、43 ℃作为正交试验发酵温度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.018.F005图5温度对芽孢数的影响2.2.5正交试验结果正交试验结果见表7。正交试验极差分析和方差分析见表8、表9。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.018.T007表7正交试验结果试验号A发酵时间/hB初始pH值C接种量/%D温度/℃芽孢数/（×108 CFU/mL)1186.05373.422186.56404.863187.07433.204246.06434.065246.57373.986247.05404.637306.07403.618306.55434.029307.06373.3210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.018.T008表8正交试验极差分析项目ABCDK111.4811.1412.1310.97K212.7613.1812.0213.35K311.2111.1311.3011.13k13.833.714.043.66k24.254.394.014.45k33.743.713.773.71极差R0.520.680.280.79主因素DBAC优组合A2B2C1D210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.018.T009表9正交试验方差分析方差来源离均差平方和自由度均方F比显著性A1.4120.7113.20**B2.8021.4026.15**C0.4020.203.72*D3.5621.7833.21**误差0.96180.05注：*表示差异显著（P0.05），**表示差异极显著（P0.01）。由表8可知，4个探究因素对芽孢数的影响程度为DBAC，最优的产芽孢发酵条件为A2B2C1D2。由表9可知，4个探究因素对芽孢数影响的显著程度为：DBAC，与极差分析结果相符。使用最优的产芽孢发酵条件A2B2C1D2进行试验，得到的芽孢数为5.13×108 CFU/mL，显著高于正交试验的最优结果A1B2C2D2（P0.05）。3讨论3.1凝结芽孢杆菌N1的生物学特性本试验探究凝结芽孢杆菌的耐温性能、耐模拟胃液性能、耐胆盐性能、对各类抗生素的敏感性、溶血活性。在生产过程中，益生菌会因为加工过程温度的变化而损失，降低利用率[26]。凝结芽孢杆菌N1在较高温度下仍保持较高的存活率，有利于生产加工。猪的胃液pH值为2.0~2.5，食物在胃中停留时间为1~2 h[22]。凝结芽孢杆菌N1经过模拟胃液处理后仍能保持较高的存活率，能较好地适应饲用益生菌在消化道中稳定性的要求。凝结芽孢杆菌在通过胃液环境，进入小肠后开始萌发生长为菌体，在小肠环境中的胆盐会抑制菌体生长[26]。凝结芽孢杆菌在胆盐环境下仍有极高的存活率，有利于该菌株在小肠环境中生存、发挥益生效果。在饲养过程中，为了治疗患病动物可能用到各类抗生素，探究该菌株的抗生素敏感性可为该菌株与抗生素的具体使用提供依据。一些芽孢杆菌具有溶血活性，不利于饲养动物的健康生长，限制其在饲料工业中的应用[24]。本试验菌株没有溶血活性，可以避免溶血活性对饲养动物带来的不良影响。该菌株具有较好的抗逆性，不具有溶血活性，是工业生产益生菌添加剂的理想菌株。3.2凝结芽孢杆菌N1的发酵条件优化本试验采用单因素试验和正交试验，探索发酵时间、初始pH值、接种量和发酵温度对芽孢数的影响，得到最优的产芽孢发酵条件为发酵时间24 h、初始pH值6.5、接种量5%、发酵温度40 ℃。在此发酵条件下，芽孢数为5.13×108 CFU/mL，具备较高的生产潜力。芽孢为芽孢杆菌的休眠体，培养环境的温度、pH值对芽孢的产生影响较大，凝结芽孢杆菌的最佳产孢pH值多为5.5~7.0[27-30]，温度多为40 ℃[26-28,30]。本试验结果与上述研究相符。不同凝结芽孢杆菌的最佳产孢时间差异较大，多为12~96 h[26-32]。随着发酵时间的延长，凝结芽孢杆菌N1的芽孢数趋于稳定。根据试验结果确定凝结芽孢杆菌N1的最佳产孢时间为24 h，有利于缩短生产周期。4结论本试验的凝结芽孢杆菌N1具有较强的耐温性能、耐模拟胃液性能、耐胆盐性能，无溶血活性，适应工业生产需求。在发酵时间24 h、初始pH值6.5、接种量5%、40 ℃的条件下，芽孢数为5.13×108 CFU/mL。优化后的凝结芽孢杆菌产孢能力得到较大提高。