萝卜（Raphanus sativus L.）是一种十字花科草本物，其叶为莱菔叶，其籽称莱菔子，全草可供药用[1]。中草药作为饲料添加剂安全系数较高，具有增强动物免疫力、促进营养物质吸收等活性功能，被广泛应用于禽畜养殖[2]。目前，中草药粉碎后以一定比例加入饲料中，该方法投入成本较高、用量和效果难以控制，并且中药提取物加入饲料的研究较匮乏[3-4]。将中草药的提取物作为饲料添加剂的研究意义重大。超声波提取被广泛用于提取各种多糖[5]，同时超声提取可以提高提取多糖的纯度[6]。因此，本试验采用超声法对萝卜多糖进行提取，为了提高提取率，使用单因素试验和响应面法优化超声辅助提取RSP，通过体外试验研究多糖的抗氧化活性，以期对RSP在饲料方面的研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料萝卜购自潍坊小绿腰萝卜有限公司；D-葡萄糖、三氯乙酸、苯酚、抗坏血酸购自上海麦克莱恩生物化学技术有限公司；DPPH购自东京化学工业株式会社；无水乙醇、浓硫酸、硫酸亚铁、二磷酸氢钾、磷酸氢二钾购自天津华东试剂厂。试验前，将100 g萝卜干粉用石油醚和75%乙醇处理24 h，脱脂，除去大部分色素和其他小分子，将过滤后的滤饼用于提取多糖。1.2试验方法1.2.1RSP的提取及分级醇沉工艺流程RSP的提取及分级醇沉工艺流程见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.013.F001图1RSP的提取及分级醇沉工艺流程1.2.2单因素试验本试验主要探索水溶性RSP，为了获得更好的多糖提取率，在单因素试验之前比较室温提取、50 ℃提取、50 ℃超声提取3种提取方法。单因素试验条件为：超声功率200~250 W、提取时间20~40 min、料液比1∶10~1∶30 g/mL。以葡萄糖为标准品，在490 nm下通过苯酚硫酸法测定多糖含量[7]。RSP的提取率按照下式计算。提取率=V×C/M×100% (1)式中：C为多糖浓度；V为溶液体积（mL）；M为萝卜粉的干重（mg）。1.2.3Box-Behnken设计基于单因素分析的结果，Box-Behnken设计3个因素和3个水平[8]，BBD产生17个阶乘点。使用二次多项式模型拟合响应（多糖提取率%）：Y%=β0+∑i=13βiXi+∑i=13βiiXi2+∑i=12∑j=i+13βijXiXj (2)式中：Y为RSP的提取率预测的响应；β0、βi、βii、βij分别为常数项、线性项、二次项和交互项的回归系数；Xi和Xj为自变量（i≠j）。1.2.4分级醇沉将RSP的提取液过滤并浓缩至原始体积的1/4，加入无水乙醇，使乙醇的最终体积分数为50%，4 ℃的冰箱中静置12 h。3 000 r/min的速度离心，将沉淀物溶解在去离子水中，离心分离得到上清液，并在冷冻干燥机中冷冻干燥，得RSP50。在上述第1次离心后，向溶液中加入无水乙醇，使乙醇的最终体积分数依次达到60%、70%、80%％、90%，并可以通过同样的方法得到RSP60、RSP70、RSP80、RSP90。1.3理化特性1.3.1蛋白质和总多酚的测定蛋白质含量根据Bradford[9]的方法确定以牛血清白蛋白为标准品。总多酚含量通过Folin-Ciocalteu比色法估算[10]，以没食子酸（GA）为标准品，以每100 mg干样品中GA的含量（GAE）表示。1.3.2单糖组成分析将10 mg的多糖加到超纯水中至终浓度为10 g/L。RSP样品的单糖组成通过柱前衍生物1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（PMP）-高效液相色谱（HPLC）方法测定[11]。将多糖样品在密封的玻璃管中用100 µL TFA（4 M）水解4 h。然后，将样品以150 μL PMP（0.5 mol/L）在70 ℃下保持1 h，并使用Diamonsil-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）分析，流速为1 mL/min，在245 nm处测定。1.3.3紫外-可见分析将5种不同的多糖溶解在超纯水中，达到1.0 g/L的终浓度，在200~600 nm的波长范围内记录样品的UV-Vis吸收光谱。1.3.4FT-IR分析将RSP样品与光谱级溴化钾粉末混合，研磨并压成小片进行FT-IR测量，FT-IR光谱记录的波数范围为4 000~400 cm-1，分辨率为2 cm-1，扫描8次。1.4抗氧化活性的测定1.4.1DPPH自由基清除活性测定根据文献[12]方法测定DPPH自由基清除活性。准确称量多糖并溶解在去离子水中以提供一系列浓度（0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 g/L）。移取200 μL不同浓度的样品溶液，与200 μL新鲜的DPPH（0.04 g/L）溶液混合。将混合物在室温下黑暗中放置30 min，使用酶标仪测量517 nm处的吸光度。维生素C（VC）用作阳性对照。DPPH自由基清除率计算公式为：DPPH自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%(3)式中：A0为对照（用去离子水代替样品）的Abs；A1为样品的Abs；A2为在与A1相同的条件下，用乙醇代替DPPH-乙醇溶液的样品的吸光度。1.4.2总还原能力测定准确称取多糖样品，溶于蒸馏水，配制成不同浓度的样品溶液（0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 g/L）。移取100 μL不同样品溶液和250 μL磷酸盐缓冲溶液（pH值6.6，0.2 mol/L），与250 μL 1％铁氰化钾溶液混合并在50 ℃下反应20 min，250 μL 10%三氯乙酸终止反应。离心后取250 μL上清液，加入250 μL蒸馏水和50 μL 0.1％氯化铁溶液，混合，静置10 min，在700 nm处测量吸光度。还原力的强度由吸光度值表示。1.4.3超氧化物自由基清除活性测定本试验中，在300 µL Tris-HCl缓冲液（16 mmol/L，pH值8.0）中产生了超氧阴离子自由基，其中含有50 µL的样品（1.0~3.0 g/L）、50 µL的NADH（还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，468 µmol/L）溶液、100 µL NBT（硝基蓝四唑，72 µmol/L）溶液和100 µL PMS（甲基硫酸吩嗪，30 µmol/L），将反应混合物在室温下静置5 min，测定560 nm吸光度。VC用作阳性对照。超氧化物自由基清除率=(1-A1/A0)×100%(4)式中：A0为对照的吸光度；A1为样品的吸光度。1.4.4羟基自由基清除活性测定根据文献[13]的方法测量清除羟自由基的能力，将反应混合物与2 mmol/L EDTA-Fe（50 µL）、3% H2O2（100 µL）和360 mg/L番红花在450 µL磷酸钠缓冲液（150 mmol/L，pH值7.4）中混合，37 °C搅拌30 min，使用酶标仪在520 nm处检测到羟基自由基。在对照试验中，样品用蒸馏水代替，磷酸钠缓冲液代替过氧化氢。羟自由基清除率=(1-A1/A0)×100%(5)式中：A0为对照的吸光度；A1为样品的吸光度。1.5数据统计与分析使用Design Expert 8.0.6和GraphPad Prism 8.0进行数据分析和绘图。结果以“平均值±标准差”表示。2结果与分析2.1提取方法的建立不同提取方法对RSP提取率的影响见图2（a）。由图2（a）可知，超声波提取10 min的效果类似于在50 ℃提取60 min的效果，且上述两者均优于室温提取。此外，每种方法的第2次提取量均比较少。因此，本试验选用超声提取并仅提取1次。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.013.F002图2不同提取方法的提取率和单因素对RSP提取率的影响2.2单因素试验结果2.2.1超声功率对RSP提取率的影响（见图2b）由图2（b）可知，随着超声功率从150 W增加到225 W，RSP的提取率增加，当超声功率设定为225 W时，多糖的产率为2.71%。从225 W到250W RSP提取率呈下降趋势，可能是由于超声波的空化效应所导致的。随着超声功率的在一定范围内的增大，超声波对细胞壁的破坏作用增强，有利于多糖分子溶出，而当功率超过一定值时，超声波在一定程度上破坏了多糖的结构，进而使得多糖的提取率下降[14]。因此，选择225 W作为最适的超声功率。2.2.2提取时间对RSP提取率的影响（见图2c）由图2（c）可知，随着提取时间的延长，RSP提取率总体呈先上升后下降的趋势，在30 min左右达到最大值。延长提取时间，提取产率下降。原因可能是提取过程中多糖需要一定时间才能溶解并扩散到水中。水中的多糖含量在30 min内持续增加，但是提取时间过长会在超声波剪切作用下破坏多糖的胶体键，甚至使多糖降解，从而导致其分子结构发生变化，进而导致RSP提取率降低[15-16]。因此，本试验以30 min作最适提取时间。2.2.3料液比对RSP提取率的影响（见图2d）由图2（d）可知，随着物料液比的降低，RSP的提取率逐渐增加，在物料液比为1∶25时，RSP的提取率达到最大值。随着水的增加，RSP的提取率呈下降趋势。可能因为当系统中的水较少时，多糖不能完全溶解并转移到水中，但是持续增加水的比例会导致超声波破坏细胞的阻力增加，使多糖难以从细胞中溶解出来，进而导致多糖提取率下降[17]。因此，选择1∶25作为最适料液比。2.3响应面试验结果分析2.3.1响应面试验设计（见表1、表2）由表1可知，提取变量的范围是根据单因素试验设计确定的。在3个级别上使用3个自变量（A超声功率、B萃取时间、C料液比）进行Box-Behnken（BBD）设计。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.013.T001表1响应面试验设计因素水平表水平A超声功率/WB萃取时间/minC料液比/(g/mL)-1200201∶200225301∶251250401∶30由表2可知，RSP提取率为1.70％~2.83％。通过BBD计算获得二阶多项式方程，并给出使RSP提取率达到最大的最佳条件。二阶多项式方程为：Y=2.81+0.021A-0.046B+0.17C-0.093AB+0.078AC-0.043BC-0.37A2-0.44B2-0.46C2 (6)式中：Y为RSP提取率（%）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.013.T002表2Box-Behnken试验设计和RSP的提取率试验号A超声功率B萃取时间C料液比Y/%101-11.9820002.8330-112.18410-12.035-1101.7260002.807-1011.7580002.7991012.21100111.87110002.8212-10-11.8813-1-101.70140-1-11.92150002.78161102.01171-102.162.3.2回归模型的方差分析（见表3）由表3可知，该模型具有高度的显著性。R2=0.997 5表明试验值与预测值之间的差异很小，Radj2=0.994 3进一步证实这一结论。线性系数和二次项系数显著（P0.05），其他项系数不显著（P0.05）。结果表明，在独立变量中，超声功率是影响RSP产量的最重要参数，其次是提取时间和料液比。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.013.T003表3回归模型方差分析方差来源平方和自由度均方F值P值模型2.910 0090.320 000 0310.100.000 1A0.230 0010.230 000 0223.910.000 1B0.017 0010.017 000 016.080.005 1C0.004 5110.004 510 04.320.076 2AB0.007 5710.007 570 07.260.030 9AC0.025 0010.025 000 023.540.001 9BC0.035 0010.035 000 033.070.000 7A20.900 0010.900 000 0867.070.000 1B20.830 0010.830 000 0792.690.000 1C20.590 0010.590 000 0564.310.000 1残差0.007 3070.001 040 0失拟项0.005 5630.001 850 04.240.098 3纯误差0.001 7540.000 043 7所有项2.920 0016R20.997 50Radj20.994 30注：*表示影响显著（P0.05）。2.3.3响应面分析（见图3）由图3可知，超声功率与提取时间之间的相互作用不明显，轮廓线更集中在超声功率侧，而超声功率方向响应面曲线在3D响应中的斜率图大于提取时间方向。因此，超声功率对RSP提取率的影响大于提取时间。从3D响应表面图中沿峰值方向和响应表面曲线的陡度的超声功率和料液比这两个因素的轮廓密度可以看出，超声功率与料液比的影响因素相差不大，但超声功率对多糖提取率的影响比料液比更显著。超声时间和料液比这两个影响因素的轮廓倾向于椭圆形，因此两者之间的相互作用明显。响应时间曲线在超声时间方向上的斜率较大，可以看出超声时间对RSP提取率的影响大于物料液比的影响[18]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.013.F003图3各因素及其交互作用对RSP提取率的影响2.3.4验证预测模型综合回归模型的统计分析表明，RSP的最佳提取工艺参数为：超声功率229.75 W、提取时间29.3 min、料液比1.0∶25.3 g/L。在此工艺条件下，RSP的提取率为2.82%。为了验证该方法分析结果的可靠性和可行性并考虑实际操作，提取工艺条件确定如下：超声功率230 W、提取时间29 min、料液比1∶25 g/mL。进行3次重复验证试验，测得RSP的提取率为2.79%，相对误差为0.23%（n=3），表明该模型具有良好的可预测性，并且试验可重复。2.4理化特性2.4.1蛋白质和总多酚含量（见图4）由图4可知，RSP50、RSP60、RSP70、RSP80、RSP90中蛋白质的含量分别为0.22%、0.18%、0.22%、0.15%、0.13%。RSP50和RSP60的总多酚含量（分别为0.27和0.11 mg GAE/100 mg，GAE为没食子酸当量）比RSP70、RSP80、RSP90（分别为0.61、1.90和1.16 mg GAE/100 mg）的总多酚含量低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.013.F004图4蛋白质和总多酚含量2.4.2单糖的组成（见表4）单糖是决定多糖独特结构和性质的天然基本单位[19]。由表4可知，每个样品主要由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，总和超过80％。其中，葡萄糖是RSP50、RSP80、RSP90的主要单糖，而RSP60和RSP70的主要单糖是半乳糖。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.013.T004表4单糖的组成组成RSP50RSP60RSP70RSP80RSP90葡萄糖（Glc）63.7734.3729.7335.3270.10半乳糖（Gal）19.1237.1833.4420.835.83阿拉伯糖（Ara）8.6220.2226.8329.348.80甘露糖（Man）2.411.722.227.729.57葡糖胺（GlcN）0.720.480.611.213.73鼠李糖（Rha）1.510.902.102.000.49糖醛酸（Glca）2.073.732.861.080.94半乳糖醛酸（Gala）1.450.901.470.99未监测到mol%2.4.3紫外可见分析（见图5a）由图5（a）可知，样品的吸收符合文献中200~600 nm的范围。在260~280 nm处有较小的吸收峰，表明多糖中存在少量蛋白质或核酸，320 nm附近的吸收峰表明多糖可能包含少量的小分子或其他杂质。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.013.F005图5RSP50、RSP60、RSP70、RSP80和RSP90的UV和FT-IR光谱（a） 紫外可见分析 （b） FT-IR分析2.4.4FT-IR分析（见图5b）由图5（b）可知，约3 407 cm-1处的强吸收带对应于羟基的拉伸振动，约2 934 cm-1处的信号归因于C-H键的拉伸振动，所有这些信号是多糖的典型特征。RSP50有1 638.73 cm-1和1 408.04 cm-1两个吸收峰，RSP60有1 629.73 cm-1和1 412.80 cm-1两个吸收峰，RSP70有1 629.14 cm-1和1 406.52 cm-1两个吸收峰，RSP80有1 618.72 cm-1和1 406.58 cm-1两个吸收峰，RSP90有1 629.44 cm-1和1 401.35 cm-1两个吸收峰，表示样品是酸性多糖，归因于酯羰基（C=O）和羧基（COO—）的拉伸振动[20]。在RSP50、RSP80、RSP90中发现1个在920 cm-1附近的特征峰，表明在3种多糖中存在α-糖苷键。RSP60、RSP70在870 cm-1附近的吸收峰表明它们的分子结构中存在β-糖苷键[21]。2.5抗氧化活性分析（见图6）2.5.1清除DPPH自由基的能力DPPH自由基是一种稳定的自由基，在517 nm处具有特征吸收，暴露于供氢物质时显著降低[22]。DPPH自由基已被广泛用于评估天然抗氧化剂的抗氧化活性。由图6（a）可知，样品具有一定的清除DPPH自由基的能力。当多糖质量浓度在0.2~1.0 g/L范围内时，RSP80具有最强的DPPH自由基去除能力，最大去除率可达89.67%，可能是由于RSP80提供更强的氢的能力[23]，其他RSP醇沉淀组分的DPPH清除能力依次为RSP90、RSP70、RSP50、RSP60。对照物VC清除DPPH的能力明显高于每种醇沉组分。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.22.013.F006图6RSP50、RSP60、RSP70、RSP80和RSP90的体外抗氧化活性2.5.2总还原能力还原力是评价化合物抗氧化活性的重要指标，可以直接反映电子给体的生产条件[24]。由图6（b）可知，每个多糖样品具有一定的总还原能力，并且随着样品浓度从0.2 g/L增加到1.0 g/L具有剂量-效应关系。尽管在1.0 g/L时具有最强还原力的RSP80仅为0.177 3，接近于当浓度达到5.0 g/L时还原力为0.211 0的云芝多糖[25]。2.5.3超氧化物自由基清除能力由图6（c）可知，所有样品的超氧化物自由基清除率在所有浓度下均显著，并且与浓度有关。然而，这5个样品比抗坏血酸清除超氧化物自由基的能力弱。在3.0 g/L剂量下，RSP50、RSP60、RSP70、RSP80、RSP90和VC的清除能力分别为70.09％、68.44％、72.18％、75.92％、72.20％和98.20％。据报道，多糖清除超氧阴离子的机理可能与O—H键的离解能有关，即与多糖连接的吸电子基团（如羧基）越多，O—H键的离解能越弱[26]。结果表明，RSP80的清除活性高于其他，可能是由于RSP80具有较高的羧基含量，并且所有样品的超氧自由基清除活性均强于茯苓多糖，当浓度为10.0 g/L时，其超氧自由基清除活性为59.30％[27]。2.5.4羟基自由基清除能力羟基自由基是最活泼的自由基之一，可以与活细胞中几乎所有的生物分子发生反应，并对相邻的生物分子造成一系列破坏[28]。由图6（d）可知，所有RSP样品和VC均以剂量依赖性方式表现出对羟基自由基的清除活性。RSP50、RSP60、RSP70、RSP80、RSP90和VC的IC50分别为3.017、2.552、2.497、2.009、2.017、0.463 g/L。清除羟基的能力与多糖中羟基或氨基的数目有关，RSP80具有较强的清除能力，可能因为RSP80可以提供更多的羟基，可能与RSP80的多酚含量较高有关。3结论本试验中，采用响应面法优化RSP的超声提取工艺，并在此基础上获得最佳工艺参数：超声功率230 W、提取时间29 min、料液比为1∶25 g/mL。通过验证测试，RSP的提取率为2.80%，相对误差为0.13%，表明所建立的模型可以较好地预测实际提取率。在UV、FT-IR和HPLC-UV之后，阐明RSP的基本组成，如Glc、Gal和Ara。另外，分级醇沉多的糖样品具有一定的抗氧化活性，对饲料开发具有潜在的作用。