淫羊藿是一种多年生草本植物，也叫短角淫羊藿、三枝九叶草、淫羊藿、牛角花，是小檗科淫羊藿属的一种植物[1]。淫羊藿是我国常用的中药，对阳痿早泄、腰酸腿痛、四肢麻木、半身不遂、神经衰弱、耳鸣等有一定改善作用[2]。淫羊藿及其活性成分具有提阳气、调节激素、调节骨质密度、调节免疫的作用；在抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抗动脉粥样硬化和抗抑郁活性等方面也有非常好的效果[3]。现代药理学研究和临床实践表明，淫羊藿中已被分离鉴定的单体化合物超过260种，主要为黄酮类化合物，其中以淫羊藿苷含量最高[4]。陈海荣等[5]发现，淫羊藿能够促进贵妃鸡胃肠道的早期发育，有利于营养物质的吸收。此外，邵谱等[6]将淫羊藿苷含量为1.0 mg/g的淫羊藿提取物混入饲料中喂养妊娠母猪，发现母猪的生产性能得到明显改善。目前，淫羊藿及其提取物已经得到广泛的研究应用，但其安全性评价尚缺，临床用药上仍存在一定的风险。因此，本试验通过小鼠的急性毒性和大鼠的亚慢性毒性作用试验，探究淫羊藿苷含量为10%的淫羊藿提取物的安全使用剂量范围，为临床应用及后期试验提供参考。1材料与方法1.1试验药物淫羊藿提取物购自陕西宝鸡方晟生物有限公司（淫羊藿苷含量为10%，批号为20181202）。1.2仪器与试剂Aida TD-5A台式低速离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）、MV-1800紫外可见光分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）、Tecan Infinite 200 PRO多功能酶标仪（帝肯（上海）贸易有限公司）、YS100尼康生物显微镜（上海蔡康光学仪器有限公司）、Hitachi-7180全自动生化分析仪（希森美康医用电子（上海）有限公司）、Sysmex-2100全自动血液分析仪（希森美康医用电子（上海）有限公司）、RM2245轮转式切片机（徕卡显微系统贸易有限公司）。谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、葡萄糖（Glu）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；血液稀释液购自美康生物科技公司；氯化钠为分析纯购自成都金山化学试剂有限公司（批号20200106）。1.3试验动物8周龄、体重20~25 g昆明系小鼠40只，SPF级体重90~120 g SD大鼠80只，雌、雄各半，均购自广西医科大学实验动物中心（动物合格证号SCXK桂2014-0002）。试验前均对小鼠和大鼠进行适应性饲养3~5 d，每天使用光源人工给予12 h照明，不限制其自由饮水，饲料购自广西医科大学实验动物中心，室温18~25 ℃，相对湿度40%~75%，室内没有对流风流动。1.4急性毒性试验1.4.1预试验选取昆明系小鼠20只随机将其分成5个试验组，每组4只，分笼饲养，试验前禁食12 h。淫羊藿提取物按体重20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 g/kg 5个剂量对小鼠进行灌胃给药，饲养7 d，观察并记录小鼠临床表现。给药后第8 d，将各试验组存活小鼠处死，进行大体解剖，观察心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脾脏、胃肠、睾丸、卵巢和子宫等是否有异常变化。1.4.2正式试验预试验小鼠未出现死亡，则进行正式试验。试验分组及方法同预试验，观察指标与预试验一致。试验中小鼠均未死亡，则进行小鼠对淫羊藿提取物的最大耐受量试验。1.5最大耐受量试验将20只小鼠分为两组，分别为给药组和对照组。称重后，给药组淫羊藿提取物按体重20 g/kg灌胃给药，对照组按同样的方式灌胃生理盐水。在给药后24 h内，观察试验小鼠是否有出现中毒反应，每天观察2次，观察试验小鼠的采食量、饮水量、精神状态、自主活动及排粪便情况等。在连续观察期的7 d内，保证其饲养条件不变。在给药第8 d，将所有供试鼠处死，进行大体解剖，检查小鼠的主要脏器是否有损伤。1.6亚慢性毒性试验为评价淫羊藿提取物的亚慢性毒性作用，试验将80只大鼠随机分为4组，即空白对照组、高剂量组（20 g /kg·BW）、中剂量组（10 g/kg·BW）和低剂量组（5 g/kg·BW），每组20只，雌、雄各半，分笼饲养，每笼10只。给药组大鼠饲料添加淫羊藿提取物，连续给药30 d。试验过程中每日观察小鼠精神状态、行为、活动、毛色、二便等一般体征，每周称重1次，并依体重变化计算药量。给药结束后，禁食12 h，每组随机取10只大鼠，雌、雄各半，腹主动脉取血，进行血液学和血液生化学检查。处死后的大鼠进行大体剖检和病理学组织学检查，测定脏器指数，即脏器重（mg）/体重（g）。取各试验组大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃肠、睾丸、卵巢和子宫等组织脏器，10%中性福尔马林溶液固定后，脱水、透明、透蜡，石蜡包埋、切片后进行H.E染色。各组剩余动物停止给药，观察1 w，同前批动物操作方法进行采血用于血液学和血液生化学指标测定，进行大体剖检、测定脏器指数和病理组织学检查。1.7数据统计与分析应用SPSS 21.0中t检验方法对数据进行比较分析，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1急性毒性试验正式试验结果显示，经过7 d的观察，5个试验组小鼠全部存活。小鼠在给药后30 min内精神略显沉郁、活动量减少，之后临床表现均正常；在随后的试验期间，饮水、采食及二便无较大变化。剖检各试验小鼠观察心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、胃、肠道等脏器未见任何异常变化，与预试验结果一致。因试验过程中每组小鼠均未出现死亡，因此未能测出半数致死量（LD50），需进行急性毒性最大耐受试验，以评价药物的安全性。依据农业农村部规定的急性毒性（LD50）剂量分级判定标准[7]，单次给药剂量超过体重15 g/kg时，动物未出现毒性反应，该药物属于无毒物质。本次试验最大给药剂量为体重20 g/kg，大于15 g/kg，因此淫羊藿提取物为实际无毒物质。2.2最大耐受量试验在最大耐受试验中各剂量组小鼠均未出现死亡情况。给药后观察，刚开始给药小鼠略显沉郁，但30 min后小鼠精神状态逐渐恢复，24 h内小鼠未出现中毒症状。观察7 d无中毒症状和死亡现象，所有小鼠食欲、精神状态、采食、饮水、排便和呼吸等活动正常；可视黏膜和被毛体征等均无异常表现。给药后第8 d剖检试验小鼠，心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、胃肠、睾丸、卵巢和子宫等脏器均未见特征性病理变化。本试验结果表明，淫羊藿提取物最大耐受量为20 g/kg·BW，小鼠各种体征和状态正常，未出现死亡，表明淫羊藿提取物的安全性较高。2.3亚慢性毒性试验2.3.1淫羊藿提取物对大鼠体重的影响（见表1）给药期间和停药后1 w内，各试验组大鼠毛色、生理活动、粪便以及呼吸等一般体征均未见异常，也未出现死亡；给药组大鼠的精神、饮食和活动等与空白对照组比无明显异常。由表1可知，给药组大鼠的体重随着日龄增加逐渐增加，淫羊藿提取物各剂量组体重与空白对照组相比均无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.015.T001表1淫羊藿提取物对大鼠体重的影响性别时间空白对照组高剂量组中剂量组低剂量组雄性给药1 w142.23±11.52140.61±12.78145.47±10.17143.21±14.39给药2 w174.10±18.74170.11±18.39172.19±17.91176.40±19.21给药3 w211.96±20.93209.52±20.10202.87±22.86207.98±21.72给药4 w250.13±33.57230.76±32.46234.17±35.36234.51±33.77停药1 w311.35±45.58300.98±42.02290.29±47.56300.72±47.52雌性给药1 w140.40±11.24133.11±11.47133.21±14.57124.14±9.16给药2 w172.99±15.23153.15±12.65163.11±16.94154.13±13.41给药3 w203.95±18.46188.18±15.03193.31±18.07185.15±15.72给药4 w235.85±20.45228.20±18.56223.23±20.23215.76±20.43停药1 w266.41±22.46249.21±20.51252.42±22.98248.16±21.78注：同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著（P0.05），不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01）；下表同。g2.3.2淫羊藿提取物对大鼠血液生理指标的影响（见表2、表3）由表2、表3可知，在给药30 d及停药1 w后，各给药剂量组大鼠的血液生理指标分别与同期空白对照组相比均无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.015.T002表2淫羊藿提取物对雄性大鼠血液生理指标的影响（n=5)项目时间空白对照组高剂量组中剂量组低剂量组血红蛋白/（g/L）给药30 d152.40±7.16147.60±9.13150.60±2.97149.20±12.6停药1 w139.00±11.85143.00±6.16141.00±10.00139.00±8.04红细胞总数/(×1012/L)给药30 d7.74±0.377.73±0.397.59±0.357.69±0.52停药1 w8.12±0.347.49±0.507.68±0.737.78±0.58白细胞总数/(×109/L)给药30 d6.32±1.618.21±1.777.82±2.336.90±2.68停药1 w9.04±5.968.57±2.996.45±2.816.23±2.33嗜中性粒细胞比例/%给药30 d15.68±0.1416.36±0.2616.62±0.5316.93±0.37停药1 w16.11±0.3315.74±0.1516.51±0.5416.15±0.47嗜碱性粒细胞比例/%给药30 d0.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.00停药1 w0.00±0.010.00±0.010.00±0.010.00±0.00嗜酸性粒细胞比例/%给药30 d0.02±0.020.03±0.020.02±0.020.02±0.02停药1 w0.55±0.120.42±0.550.42±0.180.63±0.78淋巴细胞比例/%给药30 d83.55±1.5182.67±1.7682.02±1.9182.88±2.35停药1 w82.20±3.8983.86±5.3583.04±6.2483.53±7.08单核细胞比例/%给药30 d1.07±0.061.15±0.041.15±0.051.07±0.04停药1 w1.43±0.331.10±0.181.38±0.141.05±0.1110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.015.T003表3淫羊藿提取物对雌性大鼠血液生理指标的影响（n=5)项目时间空白对照组高剂量组中剂量组低剂量组血红蛋白/（g/L）给药30 d151.80±7.36139.40±2.07144.60±9.48145.20±5.63停药1 w131.67±7.64132.00±4.18136.60±11.01139.60±13.53红细胞总数/(×1012/L)给药30 d7.13±0.596.92±0.397.55±0.497.19±0.44停药1 w6.94±0.396.78±0.407.49±0.637.23±0.58白细胞总数/(×109/L)给药30 d6.07±1.506.76±1.757.10±3.936.44±2.34停药1 w8.31±0.966.99±4.406.26±2.936.59±2.62嗜中性粒细胞比例/%给药30 d17.54±4.4420.08±5.8619.66±2.1518.60±7.73停药1 w18.93±3.5017.60±5.9921.04±9.4720.27±3.16嗜碱性粒细胞比例/%给药30 d0.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.00停药1 w0.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.00嗜酸性粒细胞比例/%给药30 d0.02±0.020.02±0.010.01±0.020.04±0.03停药1 w0.08±0.030.05±0.040.08±0.070.02±0.03淋巴细胞比例/%给药30 d81.00±4.5977.04±6.1275.18±2.3178.46±7.85停药1 w80.87±5.3081.04±6.2778.22±17.7479.47±5.12单核细胞比例/%给药30 d1.28±0.681.46±0.801.98±0.611.42±0.74停药1 w1.27±1.631.52±1.111.52±3.501.83±2.782.3.3淫羊藿提取物对大鼠血液生化指标的影响（见表4、表5）由表4、表5可知，给药30 d及停药1 w后，各给药组大鼠血液生化指标分别与同期空白对照组比较，均无显著性差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.015.T004表4淫羊藿提取物对雄性大鼠血液生化指标的影响（n=5）项目时间空白对照组高剂量组中剂量组低剂量组谷丙转氨酶/(IU/L)给药30 d51.60±21.0051.20±11.0354.20±7.1948.00±5.87停药1 w60.40±15.4749.40±2.3056.40±3.9766.00±15.98谷草转氨酶/(IU/L)给药30 d197.60±44.1194.80±31.81190.40±54.94175.80±11.80停药1 w144.00±18.15125.40±13.07120.40±12.74154.00±28.60尿素氮/(mmol/L)给药30 d3.75±0.723.58±0.344.19±0.843.66±0.44停药1 w5.20±0.954.83±0.935.07±0.794.79±1.06肌酐/(μmol/L)给药30 d30.40±1.6729.20±3.1129.80±5.6327.60±3.36停药1 w31.40±3.9129.40±3.9133.40±6.9529.60±4.04血糖/（mmol/L）给药30 d4.65±1.583.84±1.344.07±0.854.47±0.30停药1 w7.12±1.626.50±0.716.16±0.205.42±0.79总蛋白/（g/L）给药30 d57.20±1.8056.94±1.7955.70±3.6656.26±3.89停药1 w57.06±1.9557.34±2.1758.70±2.4657.36±0.82白蛋白/（g/L）给药30 d41.40±0.4842.02±1.1741.98±2.9941.68±2.20停药1 w27.50±1.4828.90±1.1128.76±0.8928.32±1.66总胆固醇/(mmol/L)给药30 d1.87±0.352.11±0.232.06±0.142.15±0.20停药1 w1.84±0.341.84±0.331.96±0.051.73±0.14甘油三酯/(mmol/L)给药30 d0.70±0.310.84±0.260.85±0.091.00±0.14停药1 w1.19±0.130.94±0.381.08±0.521.08±0.2110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.015.T005表5淫羊藿提取物对雌性大鼠血液生化指标的影响（n=5）项目时间空白对照组高剂量组中剂量组低剂量组谷丙转氨酶/(IU/L)给药30 d34.00±11.9041.00±7.0743.40±5.0843.80±7.98停药1 w42.80±5.1738.60±6.4340.40±5.6442.20±9.88谷草转氨酶/(IU/L)给药30 d188.60±28.74203.80±50.69183.00±27.34198.40±29.10停药1 w132.80±13.85125.00±24.77121.20±17.33126.20±13.10尿素氮/(mmol/L)给药30 d5.99±1.105.02±0.925.10±0.655.31±0.33停药1 w5.99±0.666.10±0.325.87±0.976.58±0.36肌酐/(μmol/L)给药30 d37.20±3.7732.80±3.4234.20±4.9233.40±4.83停药1 w35.00±2.7438.80±4.0238.60±3.6539.40±3.65血糖/（mmol/L）给药30 d3.73±0.443.66±0.773.57±0.243.97±0.49停药1 w5.81±0.705.27±0.745.74±0.596.21±0.51总蛋白/（g/L）给药30 d60.26±3.5461.70±2.3359.92±4.1160.90±3.26停药1 w63.12±1.7762.54±2.6461.50±4.5063.74±1.34白蛋白/（g/L）给药30 d44.54±2.2547.08±1.0646.02±2.8045.68±2.13停药1 w32.30±0.7931.80±1.5531.84±2.2132.30±2.01总胆固醇/(mmol/L)给药30 d1.80±0.301.98±0.362.00±0.121.75±0.35停药1 w1.79±0.201.81±0.211.70±0.251.73±0.10甘油三酯/(mmol/L)给药30 d0.87±0.190.95±0.291.22±0.300.71±0.05停药1 w1.10±.260.77±0.170.87±0.300.66±0.122.3.4淫羊藿提取物对大鼠脏器指数的影响（见表6、表7）剖检观察结果显示，各试验组大鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃肠、睾丸、卵巢和子宫等脏器形态正常、表面有光泽、色泽均匀、无肉眼可见病理变化。由表6、表7可知，给药后30 d和停药后1 w，各试验组大鼠的脏器指数与空白对照组比较，均无显著差异（P0.05），说明长期饲喂淫羊藿提取物不会导致大鼠实质脏器损伤或异常变化。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.015.T006表6淫羊藿提取物对雄性大鼠脏器指数的影响（n=5）项目时间空白对照组高剂量组中剂量组低剂量组心脏给药30 d3.76±0.103.62±0.073.69±0.153.65±0.14停药1 w3.97±0.363.73±0.073.86±0.163.78±0.05肝脏给药30 d27.71±1.0327.04±0.7726.90±0.4126.29±0.68停药1 w27.94±0.7427.03±1.0927.33±0.8826.36±0.77脾脏给药30 d1.37±0.041.34±0.071.35±0.041.36±0.07停药1 w1.52±0.081.43±0.501.52±0.071.56±0.14肺脏给药30 d4.92±0.054.81±0.054.82±0.074.81±0.00停药1 w4.21±0.174.09±0.314.10±0.244.99±0.09肾脏给药30 d7.42±0.057.33±0.097.27±0.177.38±0.14停药1 w6.66±0.206.55±0.176.79±0.236.73±0.28胃脏给药30 d8.43±0.178.40±0.088.46±0.118.39±0.16停药1 w7.40±1.277.45±0.837.97±1.127.28±1.21肠道给药30 d61.15±0.1661.63±0.2961.64±0.1261.70±0.33停药1 w61.51±0.1561.34±0.3061.50±0.1461.18±0.19睾丸给药30 d13.05±0.1412.47±0.7012.68±0.2013.02±0.60停药1 w13.97±1.7413.00± 0.1713.11±0.2613.04±0.34mg/g10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.015.T007表7淫羊藿提取物对雌性大鼠脏器指数的影响（n=5）项目时间空白对照组高剂量组中剂量组低剂量组心脏给药30 d3.30±0.113.54±0.093.07±0.533.58±0.05停药1 w3.71±0.113.61±0.053.82±0.053.76±0.09肝脏给药30 d26.89±0.9826.48±1.2726.58±1.6526.53±0.72停药1 w27.94±3.2025.79±1.1926.78±0.5227.07±0.94脾脏给药30 d1.37±0.071.27±0.061.26±0.071.42±0.07停药1 w1.48±0.191.38±0.091.61±0.101.51±0.14肺脏给药30 d4.91±0.144.73±0.054.69±0.144.92±0.08停药1 w4.04±0.144.90±0.114.11±0.154.94±0.23肾脏给药30 d6.30±0.276.11±0.076.09±0.136.19±0.09停药1 w6.45±0.056.34±0.226.69±0.216.56±0.21胃脏给药30 d8.37±0.168.30±0.098.25±0.218.42±0.08停药1 w7.75±0.987.50±0.747.60±0.527.04±0.12肠道给药30 d61.13±0.2361.79±0.1761.49±0.2961.55±0.22停药1 w61.57±0.3461.30±0.1461.19±0.1061.31±0.32卵巢和子宫给药30 d3.42±0.193.24±0.043.22±0.113.41±0.11停药1 w3.43±0.283.35±0.083.67±0.443.52±0.31mg/g2.3.5淫羊藿提取物对大鼠脏器病理组织学结构的影响（见图1）由图1可知，各试验剂量组大鼠各脏器未见特征性病理组织学变化，心肌纤维排列整齐、肝小叶结构完整、肾单位结构完整、肾小球和肾小管结构完整、其他脏器的结构亦完整，未见其他异常的病理变化。结果表明，长期饲喂淫羊藿提取物对大鼠各主要脏器的细胞未造成病理组织学损伤。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.015.F001图1淫羊藿提取物对大鼠脏器病理组织学结构的影响(H.E,×400)注：a为给药后30 d；b为停药7 d；1为空白对照组；2为高剂量组。3讨论淫羊藿富含棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸等多种成分，不仅能补充营养，还能增强机体的代谢能力，调节激素分泌，改善生殖性能[8]。研究表明，在饲料中添加淫羊藿能有效促进日本鳗鲡中卵母细胞油滴、肝脏卵黄蛋白原的增加和肌肉高度不饱和脂肪酸的积累[9]。目前，对淫羊藿毒性的研究还较少。隋海霞等[10]运用急性毒性试验、细胞毒性试验、遗传毒性试验（包括小鼠骨髓微核试验、Ames试验和TK基因突变试验）对淫羊藿进行了较系统的安全性评价，发现淫羊藿的LD50大于80 g/kg，可判断为无毒级。牛红妹[11]对淫羊藿苷进行急性毒性试验研究，发现小鼠灌胃的最大给药剂量为28.8 g/kg，淫羊藿苷口服毒性小。成静等[12]和李冬梅等[13]也证实淫羊藿提取物的安全性较高。本研究通过急性毒性试验、最大耐受量试验以及亚慢性毒性试验，从试验动物的临床表现、血液生理生化指标以及组织病理学等方面，对淫羊藿提取物进行毒理学研究。结果显示，在急性毒性试验中，给药剂量为20 g/kg·BW时试验小鼠未死亡，临床表现未见异常。随后进行最大耐受量试验，经连续7 d观察，试验小鼠健康存活，未见毒性反应，心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃肠、睾丸、卵巢和子宫等脏器未见病理变化，表明淫羊藿提取物最大耐受量为20 g/kg·BW。在连续30 d的亚慢性毒性试验中，试验大鼠的临床表现（毛色、二便、精神、行为、活动）和体重与空白对照组相比均无明显差异。经统计学分析，淋巴细胞和血红蛋白数量与空白对照组相比略有降低，血糖水平、嗜中性粒细胞和白细胞数量与空白对照组相比有所升高，但均无显著变化（P0.05）。剖检观察心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃肠、睾丸、卵巢和子宫等器官也未见特征性异常病理变化。结果表明，本试验所用淫羊藿提取物对试验动物小鼠无急性毒性作用，对大鼠无亚慢性毒性作用。有研究认为，含淫羊藿的多种中药复方制剂是具有潜在肝脏毒性的药物，长期服用会对机体有一定的损伤[14]。王琴等[15]设置淫羊藿水提物以及淫羊藿醇提物低剂量组20 g/kg生药量连续灌胃给药8 w，发现低剂量组小鼠体重仍显著低于对照组，脏器指数、血液生理生化指标也有一定的差异。这与本试验结果有些差异，可能因为本试验的试验周期短，药物毒性在大鼠的体内还未积累到可观测的程度。有研究表明，HBV携带者服用淫羊藿4个月，出现肝损伤的情况[16]，可能与淫羊藿的品种、炮制方法以及患者本身都有一定的关系[17]。目前对于淫羊藿的不良反应报告较少，还需要更多临床数据以及进一步的药理毒理结果加以证实。4结论淫羊藿提取物无毒，对连续用药1个月大鼠无毒性作用。本研究结果为该药物后期的临床试验提供参考。