秸秆细胞壁中的中性洗涤纤维（NDF）包括半纤维素、纤维素、木质素等，可为反刍动物提供重要的营养物质。因为纤维素被木质化，纤维素和半纤维素的利用率大大降低。对秸秆进行生物处理可有效提高NDF的降解率，具有耗能低、污染少、简单易行的优点[1]。青贮是生物处理秸秆的有效手段，饲喂添加菌剂的青贮饲料可有效提高羔羊的日增重[2]。近年来，对发酵菌剂改善秸秆发酵品质和化学组分、对反刍动物增重、经济效益、瘤胃消化率方面的研究较多[3-6]，对不同秸秆NDF消化率和瘤胃微生物之间关系的研究较少。目前，16S rRNA高通量测序检测方法可以对微生物群落的组成更详尽的量化[7]，已广泛应用于反刍动物瘤胃微生物的研究中[8-10]。本课题组前期分离出能降解木质纤维素的细菌，可以提高发酵玉米秸秆的发酵质量，促进绵羊能量沉积，增加净能量，提高绵羊瘤胃细菌多样性[11-13]。本研究用复合菌剂对玉米秸秆进行发酵，采用尼龙袋试验进行有效降解率的测定，进一步利用高通量测序技术对瘘管牛瘤胃微生物群落进行分析，探寻青贮玉米秸秆NDF消化率与瘤胃微生物菌群之间的相关性。1材料与方法1.1试验材料发酵玉米秸秆（fermented corn stalk，FCS）添加的微生物复合菌剂为枯草芽孢杆菌MZS-3-6、枯草芽孢杆菌Y-1d、植物乳杆菌GZ-1，发酵玉米秸秆的制备参考郭威等[13]方法。取同一时间收割的蜡熟期玉米秸秆制作常规青贮玉米秸秆（corn stalk silage，CSS），不添加复合菌剂，品种为河北农大3138。发酵玉米秸秆与常规青贮玉米秸秆的营养成分见表1。将两组样品烘干粉碎过筛，进行瘤胃尼龙袋降解率试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.014.T001表1发酵玉米秸秆与常规青贮玉米秸秆的营养成分（干物质基础）项目青贮玉米秸秆发酵玉米秸秆干物质32.6832.57粗蛋白6.336.38中性洗涤纤维63.3849.26酸性洗涤纤维39.5528.84酸性洗涤木质素3.843.16非纤维性碳水化合物39.4343.56%1.2试验动物及设计瘤胃尼龙袋降解率试验在吉林省农业科学院能量代谢实验室进行。试验中使用6头装有永久性瘘管的草原红牛，单棚（3 m×4 m）饲养，每日8：00和17：00各饲喂1次，自由饮水。粗饲料为羊草，精粗比为4∶6。精料组成及营养水平见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.014.T002表2精料组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.000玉米53.000粗蛋白/%15.00豆粕28.500消化能/(MJ/kg)11.35棉籽粕12.500玉米酒糟粕1.125小苏打1.525食盐2.000预混料1.350注：1.每千克预混料提供：Cu 8 000 mg、Mn 30 000 mg、Zn 30 000 mg、I 300 mg、Co 100 mg、VA 7 500 000 IU、VD 1 200 000 IU、VE 40 000 IU。2.营养水平中粗蛋白为实测值，消化能为计算值。尼龙袋试验采用Ørskov等[14]方法进行。将两种玉米秸秆样品烘干、粉碎并混合均匀。精确称取5.000 g秸秆样品放于尼龙袋内，采用“相同时间放入不同时间取出”的原则进行投放。瘤胃消化时间分别为0、3、6、12、24、36、48、72 h。每个时间点同一头牛放置2个尼龙袋作为2个重复。尼龙袋取出后用冷水手动冲洗至水澄清为止，65 ℃烘干至恒重，称重记录，测定营养物质含量。0 h的样本采用相同的方法进行水冲洗处理但不放入瘤胃中。尼龙袋残渣的常规营养成分的分析包括干物质（DM）、NDF、酸性洗涤纤维（ADF）的测定。DM的含量参照AOAC[15]方法测定。NDF、ADF的含量根据Van等[16]方法测定。瘤胃降解率=100%×(降解前样品中某组分的含量-降解后样品中某组分的含量)/降解前样品中某组分的含量(1)DM、ADF、NDF的瘤胃降解参数按以下模型计算：Y=a+b(l-e-ct)(2)式中：Y为样品在瘤胃内消化t时间后样品中某营养成分的降解率；a为样品某成分快速降解部分含量；b为样品某成分慢速降解部分含量；c为样品某成分慢速降解部分的降解速率；t为样品在瘤胃内的消化时间。样品中各营养成分的有效降解率根据以下公式计算：ED=a+(b×c)/(c+k)(3)式中：a、b、c为上述模型中的值；k为饲粮在瘤胃内的流通速率，采用0.05%/h。1.3瘤胃液样品的采集瘤胃尼龙袋试验结束后将6头装有瘤胃瘘管的草原红牛（500±10.0）kg随机分成两组。尼龙袋试验期两组瘘管牛粗料均为羊草，为研究不同NDF消化率的瘘管牛瘤胃微生物的变化，试验组将羊草改为等量的发酵玉米秸秆，对照组将羊草改为等量的青贮玉米秸秆，精料不变，试验期21 d。在饲喂第0、7、21 d晨饲前用抽滤泵抽取牛瘤胃内容物，样品分别命名为青贮组（CSS0、CSS7和CSS21）和发酵组（FCS0、FCS7和FCS21），用4层无菌纱布过滤后冷冻在-80 ℃下，用于DNA的提取。1.4DNA提取、16S rDNA 测序采用郭威等[13]的方法提取、纯化两组草原红牛瘤胃微生物样本总DNA。并采用5′端具有条形码的细菌特有的引物340F和805R对16S rDNA基因的V3-V4区进行扩增。PCR产物用凝胶回收试剂盒切割纯化目的条带，送至北京诺禾致源有限公司进行文库构建，并用Hiseq2500平台上机测序。1.5生物信息学分析使用QIIME[17]的ucluster方法，根据97%的序列相似度将所有序列进行同源比对并聚类成OTUs（operational taxonomic units）。使用RDP分类器[18]进行分类，获得的代表性序列从界到门、纲、目、科、属进行系统分配。对于β多样性的分析，使用统计算法Bray-Curtis计算两两样本间距离，获得β多样性距离矩阵，之后根据距离矩阵进行层级聚类（hierarchical clustering）分析，然后使用非加权组平均法UPGMA（unweighted pair group method with arithmetic mean）算法构建树状结构，并且绘制主坐标分析（PCoA）图。基于16S rRNA扩增子测序结果，通过PICRUSt对OTU丰度表进行标准化，然后通过每个OTU对应的greengene id比对到COG库，获得OTU对应的COG家族信息；并计算各COG的丰度，对其相对丰度进行组间差异性分析。1.6数据统计与分析数据采用SPSS 20.0进行统计分析，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1发酵与青贮玉米秸秆的DM、ADF、NDF瘤胃降解指数的比较（见表3）由表3可知，发酵玉米秸秆的DM、ADF、NDF有效降解率均显著高于常规青贮秸秆（P0.05），瘤胃降解参数中的a、c含量较青贮秸秆更高（P0.01，P0.05）。但两组间DM、ADF、NDF中的b含量差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.014.T003表3发酵与青贮玉米秸秆的DM、ADF、NDF瘤胃降解指数的比较项目青贮玉米秸秆发酵玉米秸秆标准误P值干物质a/%19.7022.100.570.006b/%40.2041.001.050.735c/%0.030.040.000.027ED34.0038.801.090.002酸性洗涤纤维a/%21.8523.610.400.001b/%63.5762.683.560.916c/%0.020.030.000.041ED38.4244.781.620.003中性洗涤纤维a/%15.6120.871.430.045b/%67.2760.654.810.553c/%0.010.020.000.044ED29.3338.472.210.0092.2瘤胃细菌β多样性（见图1、图2）由图1可知，FCS0和CSS0两组大部分样本聚集在一起，表明饲喂相同的饲料时，两组瘘管牛瘤胃微生物样本间基本无差异。其他样本按照组别聚集在一起，表明随着饲喂时间的延长，饲喂不同NDF消化率的玉米秸秆后，两组瘤胃微生物样本发生了不同的变化，并且组内相似性高于组间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.014.F001图1样本OTUs的主坐标分析由图2可知，样本共分为两大簇，且按照组别分为六小簇，其中CSS7和FCS7两组样本聚集在一大簇。另一簇按时间分为两簇，CSS0和FCS0两组样本聚集在一簇，CSS21和FCS21两组样本聚集在一簇。结果表明，当瘘管牛的草料由羊草向玉米秸秆转换时，在第7 d会发生巨大变化，而第21 d时瘤胃微生物趋于与原来相似的稳定状态，但又有所不同。虽然饲喂NDF消化率较低的青贮玉米秸秆和饲喂NDF消化率较高的发酵玉米秸秆后瘘管牛的瘤胃样本聚集在一起，但组内相似性更高。此结果与PCoA图结果一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.014.F002图2样本OTU水平上的层级聚类树2.3瘤胃细菌组成（见图3、表4）由图3可知，在属水平上，鉴定得到533个属，其中大多数菌属于拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门，所有样本中常见的主导菌属是理研菌科RC9肠道菌（Rikenellaceae RC9 gut group）、黏胶球形菌门RFP12非培养瘤胃细菌（Lentisphaerae RFP12 gut group-uncultured rumen bacterium）、普雷沃氏菌属（Prevotella）和纤维杆菌属（Fibrobacter）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.014.F003图3瘤胃液样本在属水平上的细菌相对丰度由表4可知，第21 d时两组的丰度大于0.1%的瘤胃菌属进行差异分析，发现共有9个具有显著性或极显著性差异的菌属。其中，发酵组FCS21的Prevotella、Prevotellaceae UCG-003、Desulfovibrio的相对丰度显著高于青贮组CSS21，Fibrobacter、Ruminobacter、Ruminococcaceae UCG-010、Ruminococcaceae NK4A214 group、Butyrivibrio、Ruminococcus的相对丰度显著（P0.05）或极显著（P0.01）低于青贮组CSS21。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.014.T004表4组间差异菌属丰度与NDF消化率的相关性分析分类单元相对丰度/%相关系数CSS（n=3）FCS（n=3）P值Prevotella8.9459.5400.0080.925 0**Fibrobacter6.1135.1680.001-0.974 0**Prevotellaceae UCG-0032.0072.3110.0180.888 0*Ruminobacter4.2023.6500.037-0.839 0*Ruminococcaceae UCG-0101.3270.9650.030-0.856 0*Ruminococcaceae NK4A214 group0.4410.3820.018-0.888 0Butyrivibrio0.4350.3940.048-0.816 0*Desulfovibrio0.4550.5730.0230.956 0Ruminococcus0.3280.2360.010-0.918 0**注：**表示极显著相关（P0.01）；*表示显著相关（P＜0.05）。通过对组间差异菌属的相对丰度与NDF消化率进行相关性分析，发现NDF消化率与Prevotella（r=0.925 0，P0.05）、Prevotellaceae UCG-003（r=0.888 0，P0.05）呈显著正相关，与Fibrobacter（r=-0.974 0，P0.05）、Ruminobacter（r=-0.839 0，P0.05）、Ruminococcaceae UCG-010（r=-0.856 0，P0.05）、Butyrivibrio（r=-0.816 0，P0.05）和Ruminococcus（r=-0.918 0，P0.05）呈显著正相关。2.4瘘管牛瘤胃微生物的16S功能预测（见图4）由图4可知，通过PICRUSt对瘘管牛瘤胃微生物进行功能预测，COG功能预测到瘤胃微生物具有25类功能，除了未知功能和普通功能预测之外，丰度由高到低的功能分别是氨基酸运输和代谢、碳水化合物运输和代谢、细胞壁/膜/包膜生物转化、转录、翻译/核糖体结构和生物转化、复制/重组和修复等，这些基因功能在两组间均差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.014.F004图4COG功能分类统计图3讨论玉米秸秆中含有高含量的纤维素，其在牛体内的消化吸收效率在一定程度上取决于玉米秸秆NDF的有效降解率。尼龙袋中干物质的减少表明作为底物的干物质更容易被瘤胃微生物所利用[19]。如果木质素降解酶分解了木质素，纤维素暴露出来更容易被瘤胃微生物分解，它的降解率必然会得到提高。Carvalho等[20]发现，添加1.0%乳酸杆菌和植物乳杆菌后干物质消化率得到提高。Moselhy等[21]报道，应用添加剂青贮的金姜花比对照组有较高的降解率。本研究中，使用复合菌剂发酵的玉米秸秆DM、NDF、ADF瘤胃有效降解率均显著提高。然而Chilson等[22]用青贮剂（4种同型发酵乳酸菌和4种水解酶）发酵的玉米秸秆与对照组的干物质降解率没有显著差异。本试验中发酵秸秆的DM、NDF、ADF可溶性部分a均比青贮玉米秸秆高，可能是因为发酵玉米秸秆较青贮玉米秸秆有更高的非纤维性碳水化合物的浓度。可溶性部分a与慢速降解速率c的显著提高使发酵玉米秸秆DM、NDF、ADF的有效降解率明显提高。日粮对瘤胃细菌群落多样性和结构影响最大[23]。通过使用高通量测序技术描述草原红牛瘤胃内的微生物菌群结构，发现发酵组和青贮组之间确实存在着很大的差异。本研究中，具有显著性差异的菌属中Prevotella、Prevotellaceae UCG-003在发酵组FCS21的相对丰度显著高于青贮组CSS21，并且与NDF消化率呈显著性正相关。而发酵组FCS21中菌属Fibrobacter、Ruminobacter、Ruminococcaceae UCG-010、Butyrivibrio、Ruminococcus的相对丰度显著低于CSS21组，并且与NDF消化率呈显著性负相关。与NDF消化率呈正相关的菌属Prevotella主要对淀粉、木聚糖和果胶进行降解[24]；而与NDF消化率呈负相关的菌属Fibrobacter、Butyrivibrio、Ruminococcus均为纤维降解菌。Butyrivibrio、Ruminococcus为厚壁菌门的菌属，它们在NDF消化率更高的发酵组FCS21丰度低于青贮组CSS21，此结果与李岚捷等[25]报道相反。原因可能是玉米秸秆发酵菌剂分泌的纤维素酶对纤维素进行降解，也可能是原虫和真菌协同参与纤维素的发酵。4结论与青贮玉米秸秆相比，饲喂发酵玉米秸秆的牛瘤胃细菌的多样性和丰富度显著提高。饲喂发酵玉米秸秆组的Prevotella、Prevotellaceae UCG-003、Desulfovibrio的相对丰度显著高于饲喂青贮玉米秸秆组。玉米秸秆的NDF消化率与瘤胃微生物的相对丰度显著正相关。