西藏高原是世界上最大的高海拔连续性生态系统，平均海拔超过4 000 m[1]。藏猪是西藏高原特有的地方猪种，生活在海拔2 900~4 100 m的半农半牧区，是藏东南地区人们重要的肉用家畜[2]。藏猪主要以放牧养殖为主，适当补饲少量的青稞、小麦等谷物，生活条件恶劣、食物来源匮乏，因此，藏猪耐粗饲和抗病力强[3]。藏猪的优良特性与其消化道中的微生物有重要关系，越来越多的研究采用藏猪肠道的微生物作为样本[4]。有研究筛选、培养出一系列具有较好纤维降解活性的微生物菌株[5]；也有研究将藏猪粪便悬浮物作为添加物，受试动物表现出较好的性能[6]。藏猪结肠容积大，是微生物栖居和发挥作用的重要场所。目前，在西藏高原饲养的藏猪，特别是放牧藏猪结肠微生物的组成与多样性等特异性状研究甚少，值得深入开展探索。采用16S rRNA高通量测序技术，比较研究放牧藏猪结肠微生物结构和组成的特异性，有利于进一步开发利用藏猪种质资源。1材料与方法1.1试验动物1.1.1放牧藏猪在典型放牧环境的林芝市巴宜区布久乡（平均海拔3 000 m，东经94.41°，北纬29.47°）选择5头身体健康、160日龄的藏猪。藏猪冬春季主要以青草、树叶、树根等为食，夏秋季主要以果实、青草、昆虫等为食，全年放牧，不需补饲。1.1.2舍饲藏猪与瘦肉型猪（杜×长×大，DLY猪）藏猪各5头，30日龄断奶后舍饲养殖于西藏农牧学院实习基地猪消化代谢室内（平均海拔2 980 m，东经94.34°，北纬29.67°），饲喂不含抗生素的配合饲料至160日龄，自由采食与饮水。舍饲藏猪与DLY猪各阶段日粮组成及营养水平见表1。饲养管理按照猪场常规程序进行。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.016.T001表1试验日粮组成及营养水平项目保育期（36~60 d）生长期（61~100 d）肥育期（101~160 d）原料组成/%玉米67.9567.6567.10小麦麸5.0010.0018.00豆粕22.0020.0013.00鱼粉2.8000石粉0.600.650.60磷酸氢钙0.350.400食盐0.300.300.30预混料1.001.001.00合计100.00100.00100.00营养水平消化能/（MJ/kg）13.6013.3012.95粗蛋白质/%18.0016.0014.00钙/%0.740.640.46总磷/%0.600.550.37有效磷/%0.320.290.14赖氨酸/%1.050.850.60蛋氨酸+胱氨酸/%0.530.430.34注：1.保育期预混料为每千克日粮中提供：铁92.00 mg、铜5.50 mg、锰3.00 mg、锌90.00 mg、硒0.27 mg、碘0.13 mg、VA 4 000.00 IU、VD 300.00 IU、VE 20.00 IU、VK 0.80 mg、硫胺素1.20 mg、核黄素4.00 mg、泛酸11.00 mg、吡哆醇1.80 mg、生物素0.10 mg、叶酸0.50 mg、VB12 18.00 μg、胆碱0.60 mg。2.生长期预混料为每千克日粮中提供：铁74.00 mg、铜4.60 mg、锰3.00 mg、锌75.00 mg、硒0.23 mg、碘0.13 mg、VA 3 200 IU、VD 240.00 IU、VE 16.00 IU、VK 0.64 mg、硫胺素0.96 mg、核黄素3.20 mg、泛酸8.80 mg、吡哆醇1.44 mg、生物素0.08 mg、叶酸0.40 mg、VB12 14.40 μg、胆碱0.48 mg。3.育肥期预混料为每千克日粮中提供：铁37.00 mg、铜3.00 mg、锰2.00 mg、锌45.00 mg、硒0.09 mg、碘0.13 mg、VA 2 400.00 IU、VD 180.00 IU、VE 12.00 IU、VK 0.48 mg、硫胺素0.72 mg、核黄素2.40 mg、泛酸6.60 mg、吡哆醇1.08 mg、生物素0.60 mg、叶酸0.30 mg、VB12 10.80 μg、胆碱0.36 mg。1.2样品采集试验猪前腔静脉放血致死，立即剖开腹腔，取出肠道，在结肠中段结扎约10 cm肠管。无菌条件下用眼科剪在结扎肠段中部剖开一小口，将食糜挤进无菌的冻存管，放入液氮中速冻，样品转入-80 ℃超低温冰箱中保存。1.3细菌总DNA提取、PCR扩增、高通量测序与分析操作程序均按照本课题组前期方法[7]。称取结肠食糜200 mg，提取细菌基因组总DNA，送样至上海派森诺生物科技有限公司，使用MiSeq PE250测序仪进行2×300 bp的双端测序。测序前按照常规测序采用前引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和后引物806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）对16S rRNA基因的V3-V4区域进行PCR扩增，检测产物质量后进行回收。将测得的序列分别进行质量筛查与配对，并按照97%的序列相似度进行分类操作单元（OTU）划分，获取分类学信息，计算alpha多样性指数（辛普森指数，Chao1指数，ACE指数，香农指数），并获取各分类学水平上微生物的组成和丰度差异。1.4数据统计与分析采用SPSS 21.0软件的One-way ANOVA程序进行差异显著性分析，采用Duncan氏法进行多重比较。2结果与分析2.1结肠微生物的OTUs划分与Alpha多样性分析2.1.1猪结肠微生物的OTUs划分结果（见表2、图1）测序共获得了661 176条有效序列，其中放牧藏猪216 258条、舍饲藏猪220 307条、DLY猪224 601条，平均长度为413.75 bp。由表2可知，去除丰度值低于全体样本测序总量0.001%的OTU，并按97%的序列相似度进行归并和OTU划分后，DLY猪结肠微生物OTU总数显著低于放牧藏猪和舍饲藏猪（P0.05），放牧藏猪与舍饲藏猪无显著差异（P0.05）。由图1可知，3个类型猪共有OTU 1 550个，放牧藏猪与舍饲藏猪单独共有OTU 714个，放牧藏猪与DLY猪单独共有OTU 429个，舍饲藏猪与DLY猪单独共有OTU 882个。独有OTU显示，放牧藏猪1 002个，舍饲藏猪1 057个，DLY猪618个。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.016.T002表2结肠微生物群落的OTU数量与多样性指数组别OTU总数辛普森指数Chao1指数ACE指数香农指数放牧藏猪1 754.80±194.65a0.97±0.01a2 024.89±188.92a2 042.95±236.80a7.92±0.38a舍饲藏猪1 647.60±149.33a0.97±0.01a1 825.54±295.74a1 888.10±340.93a7.75±0.37aDLY猪1 253.00±90.03b0.86±0.08b1 491.09±122.45b1 522.21±76.48b5.88±0.91b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），字母相同表示差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.016.F001图1猪结肠微生物群落属水平韦恩图2.1.2Alpha多样性指数分析（见表2）由表2可知，藏猪结肠微生物辛普森指数、Chao1指数、ACE指数及香农指数均显著高于DLY猪（P 0.05），放牧藏猪与舍饲藏猪间无显著差异（P0.05）。结果表明，放牧藏猪与舍饲藏猪结肠微生物群落丰富度与均匀度均好于DLY猪，而两个类型藏猪间结肠微生物群落丰富度与多样性是相似的。2.2结肠微生物群落分类学组成分析2.2.1结肠微生物群落门水平上的分析（见图2）由图2可知，3个类型猪结肠微生物共被划分为14个门，相对丰度超过1%的门分别是厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、螺旋体门（Spirochaetes）、放线菌门（Actinobacteria）及变形菌门（Proteobacteria）。放牧藏猪放线菌门和未分类微生物相对丰度显著高于舍饲藏猪与DLY猪（P0.05），舍饲藏猪拟杆菌门相对丰度显著高于放牧藏猪与DLY猪（P0.05），其他菌门的相对丰度在3个类型猪上没有显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.016.F002图2结肠微生物群落门水平上的分析注：GrazeTP：放牧藏猪、CaptiveTP：舍饲藏猪、CaptiveLP：DLY猪，下图同。2.2.2结肠微生物群落属水平上的分析（见图3）由图3可知，放牧藏猪结肠微生物群落被划分为56个属，舍饲藏猪结肠微生物群落被划分为59个属，DLY猪结肠微生物群落被划分为57个属，相对丰度排名前20的菌属。相对丰度大于1%的菌属分别是乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、链球菌属（Streptococcus）、密螺旋体属（Treponema）、梭菌属（Clostridium）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、苏黎士杆属（Turicibacter）与SMB53。3个类型猪共有7个属相对丰度有显著差异（P0.05），其中放牧藏猪双歧杆菌属、Dehalobacterium、萨特氏菌属（Sutterella）、YRC22的相对丰度显著高于舍饲藏猪与DLY猪（P0.05），舍饲藏猪瘤胃球菌属、Sphaerochaeta、Paludibacter相对丰度最高（P0.05）。具有显著差异的属中，双歧杆菌属属于放线菌门，Dehalobacterium、瘤胃球菌属属于厚壁菌门，萨特氏菌属属于变形菌门，YRC22、Paludibacter属于拟杆菌门，Sphaerochaeta属于螺旋体门。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.016.F003图3结肠微生物群落属水平上的分析3讨论猪肠道中栖居了数量庞大的微生物，主要是厌氧的革兰氏阳性细菌。细菌密度从十二指肠到结肠逐渐增加，结肠内容物中细菌的密度约为1010~1012个/g。微生物间、微生物与肠道环境、微生物与宿主之间形成一个复杂的生态系统[8]。厚壁菌门和拟杆菌门是含量最多的两个门[9]。本研究发现，结肠微生物中厚壁菌门、拟杆菌门、螺旋体门、放线菌门及变形菌门含量丰富，与前人结果相似。肠道微生物或微生物群落对维持猪的营养、生理和免疫功能起着十分重要的作用。传统的藏猪养殖以放牧为主，特殊的养殖环境塑造了藏猪独特的生理特性，如低氧适应、抗逆性强、耐粗饲与耐寒等。在放牧养殖的藏猪盲肠微生物中发现，在门水平，放线菌门与疣微菌门相对丰度比舍饲藏猪和DLY猪高；在属水平，双歧杆菌属、萨特氏菌属、费氏刺骨鱼菌属、艰难杆菌属、贪铜菌属、草酸杆菌属、丛毛单胞菌属、Shuttleworthia、Dehalobacterium、YRC22与Allobaculum相对丰度显著高于舍饲藏猪和DLY猪[7]。有研究表明，饲喂藏猪高纤维水平的青绿饲料，粪便中主要富集双歧杆菌属、苏黎世杆菌属、RFN20与Allobaculum[10]。也有研究发现，藏猪饲粮中使用90%的青绿饲料，盲肠微生物中发现大量降解纤维和与抗病力相关的微生物[11]。以上研究结果也验证了本试验结果的合理性。双歧杆菌属于放线杆菌门，是革兰氏阳性菌，广泛存在于动物的肠道中，是肠道健康指示菌，能够维持肠道微生态平衡。双歧杆菌通过形成肠道生物学屏障、产生有机酸与杀菌蛋白、分泌胞外糖苷酶等方式抑制有害微生物的繁殖进而增强机体抗病力；还可以合成多种消化酶、B族维生素与氨基酸等，促进营养物质的消化吸收[12]。本研究中，放牧藏猪结肠中双歧杆菌属的相对丰度是11.04%，远高于舍饲藏猪与DLY猪，说明放牧藏猪肠道健康程度与抗病力均高于其他两个类型猪，可以用来作为解释藏猪抗病力强的原因之一。Dehalobacterium属于厚壁菌门、梭菌纲、梭菌目、低嗜盐菌科。饲粮中添加28%燕麦提取的葡聚糖（富含可溶性纤维，含量为10.1%），小鼠结肠中Dehalobacterium相对丰度显著升高[13]。与大白猪相比，山西黑猪盲肠中聚集了更加丰富的Dehalobacterium[14]。本试验中，藏猪作为西藏高原特有猪种，主要以放牧养殖为主，食物中可溶性纤维含量高，Dehalobacterium的丰度较高，与前人的研究结果类似。萨特氏菌属属于变形菌门、变形菌纲、伯克氏菌目、产碱菌科。随着断奶日期的延后，萨特氏菌属丰度逐渐降低[15]。给25 kg纯种挪威长白猪饲喂高菜籽饼饲粮，盲肠与结肠中萨特氏菌属丰度显著升高[16]。通过移植饲料利用效率高猪的粪便微生物，母猪与后代仔猪粪便样品中萨特氏菌属相对丰度显著升高[17]。有研究发现，饲喂含生土豆淀粉的饲粮后，断奶仔猪盲肠中萨特氏菌属丰度显著下降，但小鼠则相反[18]。本课题组前期研究发现，放牧藏猪盲肠微生物萨特氏菌属丰度显著高于舍饲藏猪与DLY猪[7]。萨特氏菌属受到饲料粮不同纤维类型的影响，而放牧藏猪结肠中萨特氏菌属的分布规律与盲肠一致。YRC22属于是拟杆菌门、拟杆菌纲、拟杆菌目、帕拉普氏菌科，属于猪核心肠道微生物群[19]。有研究表明，脂肪型的荣昌猪较约克夏猪含有更高丰度的YRC22[20]。也有研究发现，在相同日龄下生长速度慢的猪粪便微生物中聚集了更高丰度的YRC22[21]。本研究及前期研究发现，藏猪盲肠与结肠微生物中YRC22丰度高于舍饲藏猪与DLY猪[7]，与上述研究结果一致。4结论西藏高原放牧藏猪生长速度慢，具有抵抗低劣饲养条件和疾病的能力，其结肠中有大量微生物与此相关，本研究的结果可为更好认识藏猪肠道微生物及进一步开发利用藏猪资源提供参考。