甘蔗是我国重要的糖料作物，云南可年产250万t蔗梢[1-2]。蔗梢含有3%~6%蛋白质、10%水溶性碳水化合物、15种氨基酸和多种维生素等[3-5]，是南方冬春季节的青绿饲料[6]，可以用于畜牧和水产养殖[7-8]。蔗梢收获的季节性强。在云南，25%的甘蔗梢被直接饲用或青贮，大部分用于自然肥田或晒干作燃料，利用率极低[9]。在蔗梢中添加纤维素酶[10]、复合微生物菌剂[11]、有机酸[12]、尿素[13-14]等可以延长甘蔗梢的保存时间，降低粗纤维含量，改善适口性，提高饲料的粗蛋白含量及干物质消化效率。鲜切蔗梢作为单一饲料饲喂杂交牛，干物质摄入量和消化率仅为5.45 kg/d、55.25%[15]。采用秸秆粗料全株玉米或象草混合60%的蔗梢，添加尿素后可使饲料干物质消化率提升至70%[16]。青贮蔗梢中添加1.6%的CaO及布氏乳杆菌（含量50 000 CFU/g）可以提供4.5%左右的乳酸和1.5%其他有机酸，防止产生乙醇和气体[17]。添加菌剂青贮与未青贮的蔗梢品质差异研究方面报道较少。因此，研究通过对添加不同发酵菌剂青贮蔗梢，对比直接自然青贮蔗梢和未青贮鲜梢在品质指标、营养指标方面的差异研究，旨在了解广谱性发酵菌剂对蔗梢青贮效果的影响，为蔗梢青贮专用发酵菌剂的研发提供参考。1材料与方法1.1试验材料及样品处理1.1.1试验材料试验甘蔗来自云南省农业科学院甘蔗研究所第一试验基地，品种为ROC 22。秸秆发酵菌剂来自不同产地，均为秸秆类广谱发酵菌剂，有效活菌数在2亿CFU/g以上。秸秆发酵菌剂情况见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.022.T001表1秸秆发酵菌剂情况编号产地有效活菌数/（CFU/g）适用范围A浙江省湖州市≥2.0×109秸秆：玉米、小麦、水稻及各类作物秸秆牧草：狼尾草、甜象草、皇竹草、蛋白桑等藤蔓：花生秧、红薯藤等糟渣：豆渣、酒糟、饼粕、潲水等B河南省南阳市≥2.0×109C河南省郑州市≥2.0×109D河南省郑州市≥5.0×109E山东省潍坊市≥2.0×1091.1.2样品处理采集蔗梢鲜重28 kg，闸刀切断至3~5 cm，混合均匀，等分成2份，每份7组（CK1为鲜梢组，CK2为自然发酵组及5个菌剂发酵组（A~E），每组2 kg。活化：称取3.0 g菌剂于锥形瓶中，加入150 mL灭活的红糖水（6.67%，m/v），报纸密封，37 ℃培养箱中活化24 h，备用；接种：菌剂发酵组A~E喷施5 mL活化好的菌剂（按蔗梢鲜重的0.005%干粉菌剂接种量计），自然发酵组CK2喷施5 mL无菌水。发酵：翻拌混匀后，转移至双层避光的塑料袋中，排尽空气，打结，胶带密封，置于120 L塑料储物箱（66 cm×44 cm×40 cm）内，以重物压实，盖上盖子，室温发酵14 d。处理：鲜梢或发酵后的蔗梢转移至托盘中，烘箱内65 ℃烘干72 h，粉碎机粉碎，过40目筛网，备用。1.2测定指标方法1.2.1水分水分按照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》直接干燥法测定。1.2.2粗蛋白及粗脂肪含量粗蛋白含量按照GB/T 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》凯式定氮法测定。粗脂肪含量按照GB/T 6433—2006《饲料中粗脂肪的测定》索式浸提法测定。1.2.3抗营养因子样品处理：取鲜梢或青贮后的蔗梢5.0 g，液氮下充分研磨，加入10 mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH值7.4）置于冰水浴中待样品融化，1.5 mL离心管收集0.5 mL上清备用。其中，磷酸盐缓冲液（PBS，pH值7.4）配制：准确称量0.27 g KH2PO4、1.42 g Na2HPO4、8.00 g NaCl、0.20 g KCl置于1 000 mL烧杯中，加约800 mL蒸馏水，玻璃棒搅拌溶解，稀盐酸调节pH值至7.40±0.05，转至1 000 mL容量瓶，加蒸馏水定容。使用胰蛋白酶抑制因子ELISA试剂盒测定样品胰蛋白酶抑制因子。尿素酶的活性按照GB/T 8622—2006《饲料用大豆制品中尿素酶活性的测定》盐酸中和法测定。1.2.4发热量按照GB/T 30727—2014《固体生物质燃料发热量测定方法》由云南解化清洁能源开发有限公司解化化工分公司测定，以每克干物质的热能表示。1.2.5水溶性碳水化合物参照余汝华等[18]玉米秸秆青贮饲料中水溶性碳水化合物测定方法研究中的方法。1.2.6纤维组分及其含量粗纤维测定参照GB/T 6434—2006《饲料中粗纤维含量的测定 过滤法》。中性洗涤纤维测定参照GB/T 20806—2006《饲料中中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）的测定》。酸性洗涤纤维测定参照NY/T 1459—2007《饲料中酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）的测定》。酸性洗涤木质素测定参照GB/T 20805—2006《饲料中酸性洗涤木质素（acid detergent lignin，ADL）的测定》。纤维素、半纤维素、木质素半纤维素、木质素参照王金主等[19]玉米秸秆中半纤维素和木质素的方法。1.2.7微生物菌群样品处理：取发酵后的蔗梢鲜样按照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》处理，生理盐水梯度稀释后涂布于不同培养基上37 ℃培养，观察。其中，菌落总数采用平板计数琼脂培养基（PCA）、乳酸菌采用乳酸菌琼脂培养基（MRS）、酵母/霉菌采用麦芽浸粉琼脂培养基（MEA）。1.2.8pH值参照王郝为等[20]芦苇青贮前后营养成分及饲用价值分析中pH值的测定方法。1.2.9有机酸含量蔗梢中有机酸测定参考白杰等[21]试验方法测定，改进的地方是样品经振荡提取24 h后，经十八烷基（封端）固相萃取柱（C18，3 mL，Amicrom）过滤，滤液用0.45 μm水系滤膜过滤，过滤后的浸提液进液相色谱分析。其中，使用Waters E2695高效液相色谱、Waters 2489紫外检测器、SunFireTM-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm×5 µm）。1.3数据统计与分析试验进行2次平行，每个平行2次重复测定，利用Microsoft Excel软件进行数据处理，采用OriginPro 8.5制图及IBM SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1蔗梢饲料的品质指标分析（见表2）青贮原料的水分和适量的可发酵碳水化合物是保证青贮过程中乳酸菌正常活动的条件和物质基础[18]。由表2可知，鲜梢的水分为73.92%，略低于发酵组，可能是因为发酵组中喷施5 mL的无菌水或活化菌液，发酵组中的鲜样水分为74.18%可以满足青贮需求，干样水分为5.79%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.022.T002表2蔗梢饲料的品质指标分析组别鲜样水分/%粗蛋白/%粗脂肪/%胰蛋白酶抑制因子/(mg/g)尿素酶活/(U/mg)发热量/(kJ/g)CK173.92±0.02a6.05±0.01a0.95±0.02a5.08±0.07e201.27±0.94c15.92±0.01aCK274.16±0.05b6.15±0.01b1.39±0.03b4.38±0.08d156.31±1.42b16.32±0.01cA74.21±0.03b6.23±0.01c1.45±0.04b3.59±0.03a134.18±1.41a16.21±0.01bB74.15±0.05b6.39±0.06e1.44±0.04b3.99±0.06c134.08±0.47a16.23±0.01bC74.19±0.03b6.33±0.02de1.42±0.04b4.07±0.03c134.05±0.47a16.43±0.01eD74.18±0.03b6.55±0.01f1.46±0.02b4.09±0.06c133.92±0.55a16.41±0.01dE74.22±0.02b6.29±0.05cd1.47±0.03b3.85±0.02b134.05±2.12a16.42±0.01de注：1.所有结果以干物质计。2.同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），小写字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。粗蛋白含量是青贮饲料的重要评价营养指标。鲜梢的粗蛋白含量为6.05%，蔗梢中粗蛋白相对青贮玉米要低2%~4%[22]。常添加豆粕、尿素、酵母菌等增加青贮蔗梢的粗蛋白含量。蔗梢自然发酵后粗蛋白提高0.10%，添加菌剂发酵组粗蛋白提高0.18%~0.50%，其中菌剂发酵组D的粗蛋白含量最大达6.55%。新鲜蔗梢中粗脂肪含量不高，仅为0.95%，发酵后可显著提高到1.39%~1.47%。自然发酵组与菌剂发酵组青贮蔗梢的粗脂肪无显著差异（P0.05）。胰蛋白酶抑制因子和尿素酶是植物中常见的酶类抗营养因子，胰蛋白酶抑制因子主要作用机理是降低胰（糜）酶蛋白酶活性，延缓生长，使得动物胰腺增生及肿大；尿素酶（或脲酶）既是动物中某些致病菌的致病因子之一，又是某些氮源性腐败物转化所必须具备的酶之一，其水解尿素产生氨和CO2，在尿素循环中产生过量的氨[23]。青贮后，两种抗营养因子含量或活性显著降低。添加菌剂发酵的蔗梢组青贮抗营养因子的含量比自然发酵组的蔗梢显著降低。添加菌剂发酵组A抗营养因子水平最低。与未发酵组相比，所有发酵组蔗梢发热量均显著提升。可能是微生物作用的结果，具体机理有待进一步研究。2.2蔗梢饲料的水溶性碳水化合物含量分析（见图1）水溶性碳水化合物含量与青贮质量呈正相关[18]。由图1可知，鲜蔗梢中水溶性碳水化合物为7.67%，自然青贮后水溶性碳水化合物降低到3.05%，添加菌剂的发酵组的水溶性碳水化合物降低到2.27%~2.76%。添加菌剂的发酵组青贮饲料碳水化合物含量显著低于自然发酵组，说明添加菌剂组中的水溶性碳水化合物被微生物利用的情况显著高于自然发酵组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.022.F001图1蔗梢饲料的水溶性碳水化合物含量分析2.3蔗梢饲料的纤维组分及含量分析（见表3）由表3可知，粗纤维含量为发酵组自然发酵组菌剂发酵组。酸性洗涤木质素、半纤维素在3个试验组中呈递增趋势。半纤维素和木质素结晶度高的结合层是反刍动物不易消化的部分，木质素含量高还会造成饲料保存困难、适口性差[24]。发酵组（包括自然发酵组和菌剂发酵组）中性洗涤纤维显著高于未发酵组，所有试验组饲料酸性洗涤纤维均无显著差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.022.T003表3蔗梢饲料的纤维组分及其含量分析组别粗纤维中性洗涤纤维酸性洗涤纤维酸性洗涤木质素半纤维素木质素CK137.54±0.27d70.34±0.32a43.06±0.508.57±0.11e27.29±0.18b8.17±0.25bCK236.28±0.02c72.84±0.18bc43.24±0.497.93±0.09d25.68±0.31a6.60±0.12aA35.24±0.44b72.26±0.31b42.58±0.016.61±0.05ab25.60±0.32a6.63±0.06aB34.13±0.90a72.43±0.12b42.09±0.306.92±0.08c25.34±0.43a6.76±0.31aC34.38±0.10ab72.61±0.48b42.79±0.956.75±0.10bc24.82±0.47a6.57±0.08aD34.18±0.17a74.46±1.61c42.89±0.256.47±0.03a25.56±1.85a6.49±0.03aE34.81±0.02ab73.05±0.33bc43.20±0.116.64±0.13ab24.85±0.22a6.53±0.16a%2.4蔗梢饲料的微生物菌群及pH值分析（见表4）由表4可知，鲜蔗梢的pH值为5.63，呈弱酸性，青贮可显著降低蔗梢的pH值，添加菌剂的发酵组pH值显著低于自然发酵组，其中最低的为发酵组D。pH值与菌落总数含量或乳酸菌呈负相关，与酵母/霉菌无相关性。乳酸菌含量会影响青贮饲料中乳酸含量，酵母菌可以适当提升青贮蔗梢的蛋白质含量，霉菌浓度会影响青贮蔗梢的品质。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.022.T004表4蔗梢饲料的微生物菌群及pH值分析组别菌落总数/(CFU/mL)乳酸菌/(CFU/mL)酵母/霉/(CFU/mL)pH值CK1NDNDND5.63±0.01fCK20.68×10100.21×10101.63×1095.03±0.01dA0.87×10100.53×10100.70×1094.79±0.02cB0.84×10100.46×10100.97×1094.77±0.01cC0.94×10100.43×10100.99×1094.70±0.02bD1.21×10100.78×10100.80×1094.65±0.03aE0.83×10100.49×10101.49×1094.89±0.01d注：所有结果以干物质计；“ND”表示未检测。2.5蔗梢饲料的有机酸含量分析（见表5）由表5可知，新鲜的蔗梢中含有微量的乳酸和乙酸，未检出丙酸和丁酸，经过发酵后的蔗梢中4种有机酸含量显著增加。菌剂发酵组中的乳酸和乙酸高于自然发酵组，自然发酵组中的丙酸和丁酸显著高于菌剂发酵组，可能因为自然发酵组相较于菌剂发酵组中的菌落总数和乳酸菌含量低，酵母或霉菌含量高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.022.T005表5蔗梢饲料的有机酸含量分析组别乳酸乙酸丙酸丁酸CK10.070±0.014a0.010±0.001a——CK20.540±0.009b0.100±0.001b0.420±0.002e0.090±0.003dA0.700±0.013cd0.130±0.003c0.250±0.007d0.040±0.002bB0.720±0.021d0.130±0.003c0.210±0.005c0.080±0.007dC0.730±0.008d0.150±0.001d0.160±0.009b0.060±0.006cD1.470±0.017e0.180±0.004e0.020±0.002a0.020±0.001aE0.670±0.009c0.130±0.004c0.030±0.007a0.030±0.003a注：所有结果以干物质计；—表示未检出。%3结论蔗梢经过自然发酵或添加菌剂发酵青贮后，其蛋白质、粗脂肪、抗营养因子和纤维含量分均能得到改善。有机酸含量提升，pH值的降低能够有效抑制腐败菌，延长青贮蔗梢的保质期。综合评价认为，菌剂发酵组D是所有试验组中最佳，其乳酸菌∶酵母菌接近1∶1，pH值为4.65，粗蛋白含量可达6.55%，粗脂肪含量1.46%，难消化的半纤维素和木质素仅为25.56%及6.49%，乳酸、乙酸含量最高分别为1.47%、0.18%而丙酸和丁酸含量最低均为0.02%。抗营养因子胰蛋白酶抑制因子菌剂发酵组A最低仅为3.59 mg/g，而5个菌剂发酵组的尿素酶活无显著差异，为134.04 U/mg。现在市场上多数发酵菌剂都是广谱性的。青贮蔗梢的品质还有更大的提升空间，尤其是针对蔗梢蛋白含量低、蔗梢纤维分高这两个劣势专用的青贮复合菌剂需要进一步研发。