科学家预测：21世纪，地球的表面温度将升高1~6 ℃。温室气体中甲烷所占比例高达16％[1]。在大气中，CH4气体潜在的增温作用是二氧化碳的21倍，对全球气候变暖的贡献率约为15%~20%，仅次于二氧化碳的贡献率[2]。大气中，CH4气体的来源一直受到各国的广泛关注。1992年政府间气候变化委员会（IPCC）的研究报告评估中确定了CH4主要的三大来源，即自然界本身排放、能源燃料废气物的排放和人类农业活动产生[3]。瘤胃发酵过程中，甲烷量的增加意味着加大能量损失和加重环境污染[4]。环境污染的加重是目前国际上更为关注反刍动物瘤胃微生物的重要原因之一，并且关注程度远超过能量浪费本身。甲烷主要是在反刍动物的前胃中由一类产甲烷菌形成。这些产甲烷菌属于古细菌亚群的范畴。只有明确存在于瘤胃中产甲烷菌的分类及其基因组序列，进而分析瘤胃产甲烷菌的基因，找到瘤胃中优势菌群，才能从普通生物学的角度更深入的理解产甲烷菌[5-6]。文章就目前在畜牧场中应用的减少甲烷气体的方法进行综述。1古细菌健康反刍动物瘤胃内栖息着多种微生物，并受多种因素的影响[7]。其中，产甲烷菌是一类严格厌氧的古细菌，隶属于广古菌门[8]，参与有机物的厌氧降解产生甲烷。产甲烷菌产生CH4主要利用纤维素菌、原虫或真菌代谢中产生的H2。瘤胃中大量的细菌、原虫、真菌，在食物消化过程中起重要作用。发酵的终产物是挥发性脂肪酸（VFAs）、二氧化碳和氢气。VFAs主要是乙酸、丙酸和丁酸。瘤胃中的VFAs是反刍动物最主要的能量来源。产甲烷菌种类很多，但都是通过一些非常相似的途径，利用H2和CO2合成甲烷。此过程中所需的酶和辅酶在其他微生物未曾发现。辅酶F420和辅酶M等是分离鉴定产甲烷菌特有的生物学标记。辅酶F420在波长为420 nm的紫灯下发出蓝绿荧光，可以在紫外荧光显微镜下对产甲烷菌细胞或菌落进行初步鉴定[8]。产甲烷菌利用H2，降低瘤胃内H2的浓度，而减少反馈抑制，使得瘤胃其他类群能够有正常的活力和发酵环境，意味着反刍动物在特定的时间内获得更多的VFAs[9]。因为高浓度的H2会抑制瘤胃微生物的活性，减慢饲料转化为VFAs[10]和产生H2的速率，所以利用耗H2的微生物会加快瘤胃发酵的速率[11]。而通过添加耗氢化合物调节瘤胃微生物，可实现甲烷减排[12]。深入研究产甲烷菌与其他微生物的种间氢传递，有助于发掘安全、可行、高效的甲烷减排途径[13]。瘤胃部分产甲烷菌的形态及能源见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.032.T001表1反刍动物瘤胃产甲烷菌的形态及能源种类形态能源反刍甲烷短杆菌短杆状H2、甲酸甲烷短杆菌短杆状H2、甲酸巴式甲烷八叠球菌不规则团状H2、甲醇、甲胺、乙酸万式甲烷八叠球菌球菌甲醇、甲胺、乙酸甲酸甲烷杆菌长杆丝状H2、甲酸运动甲烷微菌短杆状H2、甲酸目前，对不同反刍动物的古细菌进行研究，提取瘤胃内容物利用PCR技术扩增古细菌16S rRNA的基因，发现瘤胃中主要的古细菌是产甲烷菌，属于产甲烷短杆菌属中的不同类别[14]。其中有许多与甲烷杆菌M（M. ruminantium）和M. gottschalki有关联。基于目前这个属中种的定义，有8个或更多的种在这个属中。其他主要的瘤胃产甲烷菌可能属于甲烷球形菌属中的4个种，其中在本属中至少含有1个是甲烷微生物。下一步的工作是研究瘤胃微生物，包括甲烷八叠球菌属、甲烷小球菌属、甲烷杆菌属及甲烷囊菌属的已检测到的菌种，还包括对一些未知生理活性的栖居于瘤胃内的古细菌的研究。瘤胃古细菌群大部分是由瘤胃C菌群构成[15]。虽然它只占瘤胃总古细菌平均丰度的16%，然而它们中高达到80%以上被证明仍是产甲烷菌。产甲烷菌很难在实验室里培养和操作，限制了被分离的菌群数量，同时限制了鉴别产甲烷菌抑制抗原的研究和对生物学其他部分的探索。2减少甲烷产生的方法2.1疫苗法疫苗通过减少瘤胃内产甲烷菌的数量或者降低其活性减少反刍动物甲烷释放。此方法主要的优点是经济。动物注射疫苗后，机体产生大量的唾液抗体，随后产生的大量抗体进入瘤胃中，可损坏产甲烷菌菌群，从而达到控制瘤胃产甲烷菌的目的。羊每天产生1~3瘤胃体积的唾液，而牛每天产生1.5~2.5瘤胃体积的唾液[15]。基于对产甲烷菌生长或（和）甲烷生成起重要作用，并且在不同产甲烷菌之间有交叉反应蛋白的研究，目前正运用两种方法制备亚单位疫苗。第一种方法是利用从M.ruminantium基因组获得的信息[16]，分析他的表面和膜结合蛋白，确认71个可以作为制备抗产甲烷菌疫苗的候选蛋白。其中有18个参与能量代谢，主要与Eha/Ehb脱氢酶复合体或Mtr酶复合体有关。将这些蛋白在异种（大肠杆菌）中表达并纯化，将其作为抗体免疫羊。针对这些蛋白产生的抗血清，在体外被用于检测抑制M.ruminantium生长及减少甲烷产量的研究。第二种方法，利用免疫羊产生的抗血清来破坏M. ruminantium菌的亚细胞结构。抗血清已经被用于抑制体外培养的M.ruminantium的试验和干扰一定细胞组分，减少微生物生长和CH4气体的试验[17]。目前，运用免疫的和生物化学的技术已被确认能够干扰亚细胞上的特异性蛋白的抗血清。这种方法将为选择和筛选制备疫苗适当候选基因提供一个平台。另外，鉴定能够加强唾液抗体反应的研究也在进行。2.2细菌噬菌体法细菌噬菌体存在于所有的生物生态系统中。细菌噬菌体结构简单和模块化[18]，是在各种微生物宿主之间进行遗传物质的交换的重要中介者[19]。此外，噬菌体的吸附、穿透宿主细胞，然后裂解宿主细胞的能力，使噬菌体和其基因成为减少甲烷策略的潜在资源。目前将近有300中细菌噬菌体的基因组[20]被报道，已测序古细菌噬菌体仅有6个，并且仅有2个是产甲烷菌的噬菌体。一种是产甲烷杆菌属的噬菌体psi M1和M2（M1的一个变种），另一种是产甲烷嗜热菌属噬菌体psi M100。同时，研究人员利用电子显微镜和体外培养技术，检测和报道了更多的古细菌噬菌体[21]。但是，关于古细菌的遗传图谱和基因的功能的可用信息非常少，尤其是关于产甲烷菌噬菌体的则更少。从M. ruminantium基因组序列中发现了原噬菌体φmru，它包含69个与噬菌体相关的蛋白。其中编码噬菌体裂解酶的基因已经被确定，并通过这个基因表达出的噬菌体裂解酶，裂解了M. ruminantium的细胞。这个裂解酶是生物控制CH4气体产生的可行的选项[22]。噬菌体对其宿主的种类，乃至菌株的要求具有相当高的特异性。基于噬菌体方法减少甲烷排放的策略要应用噬菌体的这种特异性。在除去特异性产甲烷菌的同时，不要影响瘤胃内其他遗传种系不同的微生物。但是，宿主和噬菌体在进行着进化的竞赛，宿主为避免噬菌体的侵染发生改变，而噬菌体为保持其传染性也在发生着改变。应用其他噬菌体的酶和结构元件结合一个旋转系统，可以克服微生物对侵染它的噬菌体的快速适应机制。为了应用基于噬菌体的策略，许多的产甲烷菌的噬菌体需要被鉴定，测序和赋予鉴定它的特征。但是，因为瘤胃中产甲烷菌种类繁多，所以在减少甲烷排方面噬菌体的高度特异性可能是一个限制噬菌体效果的因素[23]。2.3除虫法除去原虫后，CH4气体约能降低13%。但是原虫的数量受日粮的影响大，除虫会引起以饲喂浓缩日粮的反刍动物甲烷释放量急剧减少，减少的幅度在20%到42%。通常以粗饲料为主的反刍动物，瘤胃中有较少的原虫大约为104~105/mL，而以谷物为主的大于106/mL。因此，在牧场中，对于以饲草为主的反刍动物，利用驱虫的办法减低甲烷生成量的效果是非常不显著的[25]。尽管除虫的方法有所保留，但是它代表在畜牧场中减低反刍动物甲烷释放一种潜在可行的方法。以下4种控制原虫的方法，虽然每种都存在一些缺陷，但在食草类家畜生产系统中应用也有突出的优点。（1）分离培育一代单体的原虫（用肉牛和奶牛中更容易分离成功）；（2）基于营养水平的除虫，例如可以通过短期饲喂高谷物日粮，会导致瘤胃pH下降，从而杀灭原虫；（3）化学除虫法（通常用洗涤剂），是试验室最常用的方法；（4）利用含皂苷[26]和油类物质法。有些情况下，油类物质也可以直接影响产甲烷菌的活动[27]。通过生物分离和基于营养的方法已经改良出不携带原虫的畜群[28]。但是化学试剂对畜群有毒副作用，所以这两种方法都没有被广泛应用[25]。利用原虫的全细胞作为抗原免疫动物没有达到明显的效果。同时，用特异性的原虫抗原可能会提高疫苗的效果。尽管关于产甲烷菌与原虫表面蛋白的交互作用知之甚少，但是大量黏附素样辅助蛋白已在M. ruminantium被发现[26]。这些蛋白或许介导部分与原虫交叉反应，并且可以作为将来疫苗的抗原。未来，应加快对特异性好、效果明显的原虫抑制剂的研发，包括运用分子手段调控原虫，原虫的培养和原虫基因组的测定。而且，可以利用某些种或（和）属原虫特异性靶部位，在提高对原虫产生最大的效果的同时，最低限度地降低有害作用。2.4草原放牧制度的营养策略饲喂不同组分的日粮可以减少反刍动物甲烷的释放量。在羊的日粮中添加一定的油类物质可以减少甲烷释放量高达27%[29-30]。上述结果是以下的两种因素导致的，即脂肪酸的还原反应与产甲烷菌竞争底物；脂肪酸本身能够直接抑制产甲烷菌。这些效应依赖于脂肪酸的来源，并且结果是可变的。应用油类制剂对纤维降解也能产生负面影响，因而限制这些成分在降低甲烷上的应用。另外，给动物服用油类物质存在很大质疑。消化可溶性糖类产生的CH4气体比植物纤维产生的要少[31]，饲料中增加可溶性糖类含量或许是另一种减少甲烷的方法。植物含有的单宁类和皂苷类物质，有潜在降低甲烷的作用[32-33]。单宁酸和皂苷的浓度和活性与植物的种类和年龄有关，所以很难预测这两类物质的作用效果，在研究过程中可能出现各种不同的结果[34]。有研究表明，给北澳大利亚的肉牛补充Desmanthus热带豆科植物可以减少体内甲烷的排放[35]。张力莉等[36]研究表明，葡萄残渣显著降低了体外瘤胃培养24 h产气量中甲烷的比例。苏汉书等[37]研究表明，青蒿提取物可减少甲烷生成，可作为调控奶牛瘤胃甲烷抑制的绿色添加剂。有研究饲喂天然牧草与杜鹃花混合饲粮的马鹿和绵羊，发现随着饲粮中埃里克科植物比例的增加，单位可消化有机物的甲烷排放量降低，但由于饲粮中埃里克科植物比例与可消化有机物的摄入量之间存在显著的交互作用，建议通过实施碳信用来评估heathland系统在促进生物多样性方面的重要性，以及它在反刍放牧系统减少甲烷排放方面的潜在贡献[38]。2.5动物基因型和育种培育高生产性能的动物，通过调高饲喂能量饲料的比例，减少CH4气体的释放[39]。王冰等[40]指出，甲烷生产可能潜在地被动物个体瘤胃形态学和功能差异影响，动物遗传学可能会影响甲烷生产机理。3结论瘤胃产甲烷古细菌全谱和种类的确定是未来设计积极有效疫苗和酶抑制剂成功控制减少甲烷关键的一步。以上策略各有利弊，用户应该根据其可行性和投入成本加以选择，在发展的不同阶段选取不同的方法。