近年来，中药材在人类健康和动物保健领域的应用越来越广泛，中兽药行业飞速发展，出现中药材资源的供不应求等问题。中药提取物作为中兽药行业研究热点和重要开发方向，在提取过程中药渣的处理方式受到研究人员的重视。据报道，我国每年中药提取后的药渣总量约为3 000万t，且数字还在增加[1]。目前，药渣的处理方式主要以掩埋、焚烧为主，不仅消耗资源、利用率低[2]，还容易造成环境污染[3]。中药药渣本身具有较高的活性，简单处理可以进行二次利用。因此，本研究对山银花、黄芩、杜仲3味中药提取后的药渣进行发酵，并优化其发酵条件，为中药药渣的二次利用提供参考。1材料与方法1.1样品来源本研究样品为山银花、黄芩和杜仲提取后药渣，由湖南长沙世唯生物科技有限公司提供。1.2复合发酵菌剂复合发酵菌剂由米曲霉、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母及嗜酸乳杆菌作为发酵菌种，购自广州市微元生物科技有限公司，活菌总量≥2×1010 CFU/g。1.3仪器与设备AL104电子天平购自梅特勒-托利多公司；娥江-MC标准筛购自长沙中意筛具仪器公司；101型恒温鼓风干燥箱购自北京市永光明医疗仪器厂；LC-20AT高效液相色谱仪购自日本岛津公司；FW100样品粉碎机购自天津泰斯特公司。1.4中药药渣预处理将山银花、黄芩、杜仲提取后药渣烘干，粉碎，过40目标准筛，按照1∶1∶1的比例混合，待发酵处理。1.5药渣与药渣发酵后活性成分检测研究中使用的山银花和杜仲药渣所检测的主要活性物质为绿原酸，黄芩药渣所检测的主要活性物质为黄芩苷。绿原酸检测方法参考《GB/T 22250—2008保健食品中绿原酸的测定》。具体步骤为：精确称量约1 g样品于25.0 mL容量瓶，加入20 mL 70%甲醇，超声波提取30 min，用70%甲醇定容至刻度线，混合均匀，0.45 μm滤膜过滤，收集滤液待液相色谱分析；分别吸取绿原酸标准使用液，使用流动相稀释并再容量瓶中定容的浓度分别为2.0、10.0、20.0、40.0、80.0 mg/L，用于制作标准曲线；色谱柱为ODS C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为9∶1的0.5%乙酸和乙腈混合液；液体流速1.0 mL/min；柱温35 ℃；检测波长327 nm；进样量10 μL。绿原酸计算公式如下：X=c×V×1 000m×1 000×1 000 (1)式中：X为试样中绿原酸含量（μg/g）；c为由标准曲线求得进样液中绿原酸的浓度（mg/L）；V为试样定容体积（mL）；m为试样质量（g）。黄芩苷检测方法参考《DB34/T 3474—2019饲料中黄芩苷的测定 高效液相色谱法》。具体步骤为：精确称取适量样品约1 g，置于100 mL磨口三角烧瓶中，准确加入甲醇溶液50 mL，置于超声波仪中提取0.5 h。取试样提取液20 mL转移至离心管，3 000 r/min离心10 min，取离心上清液2 mL，用0.45 μm尼龙过滤膜过滤，收集滤液待测；色谱柱为C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为磷酸溶液（0.025 mol/L），流动相B为乙腈；液体流速1.0 mL/min；柱温为室温；检测波长277 nm；进样量20 μL。黄芩苷计算公式如下：X=C×Vm×f (2)式中：X为黄芩苷含量（μg/g）；C为试样色谱峰对应的黄芩苷浓度（mg/L）；m为试样质量（g）；V为定容体积（mL）；f为稀释倍数。1.6单因素试验本研究以发酵时间、发酵接种量、发酵温度为影响复配中药药渣绿原酸和黄芩苷含量的因素，首先对3个因素进行优化。1.6.1发酵时间以0.2%复合菌剂接种量、34 ℃，发酵时间分别为8、16、24、32、40、48 d为条件进行发酵。将发酵产物在65 ℃条件下烘干至恒重，粉碎过40目筛，测定发酵物中绿原酸和黄芩苷含量，每组设置3个平行。1.6.2发酵接种量分别以0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%复合菌剂接种量进行接种，温度为34 ℃，连续发酵24 d。将发酵产物在65 ℃条件下烘干至恒重，粉碎过40目筛，测定发酵物中绿原酸和黄芩苷含量，每组设置3个平行。1.6.3发酵温度按照0.2%复合菌剂接种量，分别在31、32、33、34、35、36 ℃条件下，连续发酵24 d。将发酵产物在65 ℃条件下烘干至恒重，粉碎过40目筛，测定发酵物中绿原酸和黄芩苷含量，每组设置3个平行。1.7正交试验确定最优参数条件根据单因素的试验结果，确定影响复配中药药渣中绿原酸和黄芩苷的主要影响因素数值区间，以发酵时间（A）、发酵接种量（B）、发酵温度（C）进行发酵工艺优化试验。每个因素设3个水平，每组设置3个平行试验。根据正交试验设计原理，根据复合药渣发酵物绿原酸和黄芩苷含量总量（两种活性物质含量之和）为评价指标对发酵工艺做出最优评价。L9（34）正交试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.020.T001表1L9（34）正交试验因素水平设计水平A发酵时间/dB接种量/%C发酵温度/℃1240.3322320.4333400.5341.8数据统计与分析数据使用SAS 9.4进行方差分析，结果以平均值表示。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1不同发酵时间对药渣活性物质含量的影响（见表2）由表2可知，随着发酵时间的延长，绿原酸含量分别提高13.64%、34.85%、56.06%、59.09%、54.55%、45.45%，黄芩苷含量分别提高10.45%、24.42%、32.56%、39.53%、33.72%、26.74%，总活性物质含量分别提高11.84%、28.95%、42.76%、48.03%、42.76%、34.87%。在发酵时间达到32 d，活性物质含量达到最高，然后随着发酵时间延长活性物质含量会有所降低，发酵时间的最佳区间为24~40 d。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.020.T002表2不同发酵时间对药渣活性物质含量的影响项目对照组发酵时间/d81624324048绿原酸0.660.750.891.031.051.020.96黄芩苷0.860.951.071.141.201.151.09活性物质总量1.521.701.962.172.252.172.05mg/g2.1.2不同接种量对药渣活性物质含量的影响（见表3）由表3可知，随着接种量的提高，绿原酸含量分别提高10.61%、56.06%、68.18%、71.21%、50.00%、28.79%，黄芩苷含量分别提高8.14%、32.56%、43.02%、41.86%、30.23%、11.63%，总活性物质含量分别提高9.21%、42.76%、53.95%、54.61%、38.82%、19.08%。在接种量达到0.4%时，总活性物质含量达到最高，当超过0.4%添加量时总活性物质呈降低趋势，接种量最佳区间为0.3%~0.5%10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.020.T003表3不同接种量对药渣活性物质含量的影响项目对照组接种量/%0.10.20.30.40.50.6绿原酸0.660.731.031.111.130.990.85黄芩苷0.860.931.141.231.221.120.96活性物质总量1.521.662.172.342.352.111.81mg/g2.1.3不同发酵温度对药渣活性物质含量的影响（见表4）由表4可知，随着发酵温度的提高，绿原酸含量分别提高7.58%、48.48%、65.15%、56.06%、54.55%、37.88%，黄芩苷含量分别提高9.30%、36.05%、43.02%、32.56%、27.91%、13.95%，总活性物质含量分别提高8.55%、41.45%、52.63%、42.76%、39.47%、24.34%。在发酵温度达到33 ℃时，总活性物质含量达到最高，发酵温度最佳区间为32~34 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.020.T004表4不同发酵温度对药渣活性物质含量的影响 单位：mg/g项目对照组发酵温度/℃313233343536绿原酸0.660.710.981.091.031.020.91黄芩苷0.860.941.171.231.141.100.98活性物质总量1.521.652.152.322.172.121.892.2正交试验极差分析及方差分析（见表5、表6）由表5、表6可知，发酵时间对药渣活性总物质含量影响极显著（P0.01），而接种量和发酵温度对总活性物质含量有显著影响（P0.05）。分析结果k值，建议3种中药复配方案的最佳发酵工艺为A2B2C3，即发酵32 d、接种量为0.4%、发酵温度为34 ℃。根据R值可知，活性物质总量影响因素影响从高到低依次为A、B、C。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.020.T005表5正交试验极差分析试验序号A发酵时间/dB接种量/%C发酵温度/℃绿原酸/(mg/g)黄芩苷/(mg/g)活性物质总量/(mg/g)1400.5320.650.921.572240.4341.131.222.353400.3340.951.031.984240.5330.831.061.895320.5341.081.212.296400.4330.781.061.847320.4321.151.272.428320.3331.211.322.539240.3320.761.031.79k12.0102.1001.927k22.4132.2032.087k31.7971.9172.207R0.2050.0950.09310.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.020.T006表6方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型0.83360.145.640.028 3A发酵时间0.58820.2911.940.007 0B接种量0.12620.062.570.028 0C发酵温度0.11820.062.400.029 0误差0.04920.02校正合计0.88382.3最佳工艺参数验证结果（见表7）按照A2B2C3最佳发酵工艺重新进行发酵生产，验证6次。由表7可知，总活性物质的平均含量为2.60 mg/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.020.T007表7最佳工艺参数验证结果类型123456平均值绿原酸1.241.251.221.251.231.241.24黄芩苷1.371.341.361.351.381.381.36活性物质总量2.612.592.582.62.612.622.60mg/g3讨论3.1发酵时间对发酵效果的影响微生物发酵饲料采用特殊工艺和特质包装对目标饲料进行发酵，利用微生物新陈代谢和菌群增殖而形成大量益生菌和对动物有益的代谢产物，并对其中潜在的有害物质进行分解[4]。主要的代谢产物包括必需氨基酸、有机酸、维生素等物质[5]。本研究利用微生物对中药渣进行发酵，主要是通过发酵破坏植物细胞结构，将其中所包含的药用活性物质进行释放，从而达到资源高效利用的目的。发酵时间是重要的影响因素之一。陈鑫等[6]以红芪药渣为原料，利用白腐菌/产朊假丝酵母混合菌种进行发酵，以蛋白含量最优为目标进行工艺参数优化研究。结果显示，随着发酵时间提高，发酵饲料中蛋白含量先升高后下降，与本研究对活性物质的影响结果变化规律类似。该研究认为，5 d为最佳发酵时间。李群华等[7]研究不同发酵时间对益生菌发酵饲料营养成分、体外消化率及饲料品质的影响，结果表明，随着发酵时间的增加，饲料中粗蛋白（CP）含量持续显著升高，但发酵第10 d和发酵第15 d差异不显著，且发酵第15 d真蛋白率显著低于发酵第30 min；氨态氮（NH3-N）含量和CP体外消化率均随着发酵时间延长极显著增加；与发酵第30 min相比，各时间点干物质回收率均显著降低；饲料中乳酸菌数量随着发酵时间的延长先上升后下降，发酵第10 d乳酸菌数量最高；乳酸含量随着发酵时间延长持续极显著升高，综合各项指标该研究认为发酵最佳时间为6 d。研究表明，发酵效果随着发酵时间的延长呈先上升后下降的趋势，这可能因为随着时间延长，微生物数量增大，需要更多的营养物质支撑其增殖，从而发酵时间过长导致微生物所需物质无法被满足而引起活性成分被代谢而降低。本研究较上述研究的最佳发酵时间偏高，与本研究以药学活性物质最高为最佳指标有关。3.2微生物接种量对发酵效果的影响发酵菌剂接种量越高，单位药渣的发酵效果越快，且微生物增殖量也越高，从而导致所需要的营养越多。因此，在指定发酵温度和发酵时间下，总活性物质含量随着接种量的提高呈先增加后降低的趋势。秦梦等[8]利用正交试验法优化中药渣有机肥发酵工艺中发现随着菌剂接种量增加，发酵越充分，但当菌种接种量超过0.5%时，效果有显著降低。魏丽娟等[9]在黄芪药渣中添加不同浓度的乳酸菌，结果显示随着在低于140×107 CFU/g的添加量内，发酵产物蛋白含量呈线增加，当超过该接种量时蛋白含量有一定程度下降。上述结论与本研究结果类似。3.3发酵温度对发酵效果的影响韩愈杰等[10]在双黄连药渣发酵条件优化的研究中发现，随着发酵温度的提高，药渣中连翘苷和蛋白含量具有波动变化，在37 ℃时达到顶峰。该研究认为，37 ℃为最佳发酵温度。孙晓燕等[11]以药食同源中药渣为试验材料，利用植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和安琪啤酒酵母混合菌剂对其进行发酵。该研究认为，25~37 ℃为发酵最佳温度区间，在此区间范围内温度对发酵效果的影响差异不显著。该结论与本研究不一致，可能是混合菌剂不一致且发酵时间较短引起的。发酵温度对发酵效果的影响显著，在合理温度下，微生物体内酶活性达到最高，进而其代谢速率达到最大[12]，发酵最佳温度会受发酵底物和发酵菌种的影响。4结论本研究使用的山银花、黄芩、杜仲3味中药药渣推荐的发酵工艺参数为发酵时间32 d、接种量为0.4%、发酵温度为34 ℃。