产气荚膜梭菌是一种厌氧型的革兰氏阳性杆菌，是一种条件致病菌，正常鸡肠道含有102~105 CFU/g食糜[1]。在动物的生产过程中，卫生条件差、饲料比重不当等原因会造成家禽肠道中菌群失衡，导致产气荚膜梭菌大量繁殖、产生毒素，引起畜禽出现坏死性肠炎等疾病[2]。据统计，每年因为坏死性肠炎导致的全球畜禽业经济损失高达20亿美元[3]。近年来，由于饲料中抗生素的限制使用，畜禽中坏死性肠炎的发病率有所上升[4]。益生菌可以通过分泌细菌素和降低肠道pH值来抑杀Cp[5-7]；益生菌可以降低产气荚膜梭菌α毒素的产生，还可以降解α毒素[6]；另外，益生菌可以减少产气荚膜梭菌对肠细胞的黏附[8]。益生菌具有抗炎作用[9-10]。益生菌可增加抗Cp的黏膜局部抗体免疫球蛋白A（IgA）含量，降低鸡肠道中Cp的负载量[11-12]。因此，本研究期望筛选出对产气荚膜梭菌具有良好抑制作用甚至能够杀灭产气荚膜梭菌的菌株，为益生菌用于防控由产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎提供参考。1材料与方法1.1材料1.1.1试验试剂恩拉霉素购自浙江益丰制药有限公司。1.1.2菌种指示菌：产气荚膜梭菌，编号为SA12，分离自坏死性肠炎死亡鸡只的肠道。益生菌种：枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、苏云金杆菌、菊糖芽孢乳杆菌、丁酸梭菌均由生物源生物技术（深圳）股份有限公司提供。1.1.3培养基RCM培养基：胰蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉10 g/L、葡萄糖2.5 g/L、氯化钠5 g/L、酵母浸粉3 g/L、乙酸钠3 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L、琼脂15 g/L，使用NaOH调节至pH值6.8。加富MRS培养基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、牛肉膏5 g/L、葡萄糖5 g/L、无水氯化钙0.15 g/L、氯化钠2.5 g/L、一水合硫酸锰0.1 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L、琼脂20 g/L，使用NaOH调节至pH值5.3。LB培养基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏5 g/L、氯化钠5 g/L、琼脂20 g/L，使用NaOH调节至pH值7.2。产气荚膜梭菌测定用培养基：多价胨15 g/L、大豆胨7.5 g/L、酵母浸7.5 g/L、牛肉浸粉7.5 g/L、柠檬酸铁铵1 g/L、偏重亚硫酸钠1 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.75 g/L、琼脂20 g/L，使用NaOH调节至pH值7.6。1.1.4仪器设备LS-B75C-I立式压力蒸汽灭菌锅（江阴滨江医疗设备有限公司）、HK-C2S型单人双面垂直洁净工作台（广东环凯微生物科技有限公司）、SPX-250B-Z生化培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、酶标仪（PE公司）。1.2试验方法1.2.1筛选对产气荚膜梭菌具有抑制作用的益生菌以产气荚膜梭菌SA12为指示菌，采用混板打孔法，测定试样对其的抑菌敏感性。分别称取0.5 g丁酸梭菌菌粉于RCM肉汤中，37 ℃培养24 h；0.5 g凝结芽孢杆菌菌粉和0.5 g枯草芽孢杆菌菌粉分别于加富MRS和LB液体培养基中，42 ℃培养36 h、37 ℃培养24 h。将发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和菊糖芽孢乳杆菌斜面菌株分别接种到MRS培养基，37 ℃培养24 h。将苏云金杆菌接种到LB培养基，37 ℃培养48 h。将上述发酵液于5 000 r/min离心5 min，取上清液，过0.45 μm滤膜，取滤液备用。将100 μL滤液加入产气荚膜梭菌的混板抑菌孔中，37 ℃厌氧培养24 h，测定其抑菌圈大小。1.2.2芽孢杆菌发酵液对产气荚膜梭菌的最低抑菌浓度采用二倍稀释法，测定MIC值，具体如下：采用饲料级乳酸分别调节1.2.1中各菌体（枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌）发酵液pH值为3.5，将该发酵液于5 000 r/min离心10 min，取上清液，过0.45 μm滤膜，备用。于无菌96孔板中，加入100 μLRCM肉汤，接着在第1列和第2列加入100 μL上述滤液，从第2列开始，分别按二倍稀释法稀释至第10列，每个孔中分别加入100 μL产气荚膜梭菌SA12菌液（5×105 CFU/mL）。37 ℃厌氧培养24 h，培养基结束后测定OD630 nm并结合肉眼观察，判定MIC值[13]。同时做RCM培养基（pH值3.5）MIC，各菌体发酵上清液MIC。以200 μLRCM培养基为空白对照，100 μL RCM培养基+100 μL菌液为阴性对照。恩拉霉素MIC（母液浓度为20 mg/kg）为阳性对照。1.2.3酸化芽孢杆菌发酵液对产气荚膜梭菌生长的影响用饲料级乳酸调节1.2.2中各菌体发酵液（枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌）pH值为3.5，将其于5 000 r/min离心10 min，取上清液，过滤膜，备用。以此为母液，分别稀释丁酸梭菌、凝结芽孢杆菌上清液至125.00、62.50 mg/g，枯草芽孢杆菌上清液至125.00、62.50、31.25 mg/g。分别取1 mL产气荚膜梭菌SA12菌液（4~5×105 CFU/mL）和1 mL上述发酵液于2 mL EP管中，混匀，37 ℃培养，每隔2 h取样测定OD630 nm值。以时间为横坐标，OD630 nm为纵坐标，绘制产气荚膜梭菌的生长曲线。同时做阴性对照和恩拉霉素阳性对照，试验重复3次。1.2.4芽孢杆菌与产气荚膜梭菌共培养对产气荚膜梭菌生长的影响将枯草芽孢杆菌菌体洗涤，采用RCM培养基重悬（1×105 CFU/mL）和产气荚膜梭菌SA12（1×105 CFU/mL）以5%的接种量共同接种于100 mL的RCM肉汤中（150 mL锥形瓶），37 ℃厌氧培养48 h，每隔12 h，取样。枯草芽孢杆菌采用十倍稀释法，LB培养基混板，37 ℃培养18 h，计数。产气荚膜梭菌采用十倍稀释法，产气荚膜梭菌测定用培养基混板，37 ℃严格厌氧条件培养18 h，计数。以时间为横坐标，菌数的对数值为纵坐标，做产气荚膜梭菌和枯草芽孢杆菌共培养生长曲线。同时以单独产气荚膜梭菌和枯草芽孢杆菌培养为对照，试验重复3次[14]。将凝结芽孢杆菌菌液采用RCM培养基洗涤，重悬（1×105 CFU/mL），再分别取1 mL凝结芽孢杆菌和产气荚膜梭菌SA12（1×105 CFU/mL）共同接种至无菌EP管（2 mL EP管）中，37 ℃厌氧培养48 h，每隔12 h，取样。产气荚膜梭菌采用十倍稀释法，产气荚膜梭菌测定用培养基混板，37 ℃严格厌氧条件培养18 h，计数。以时间为横坐标，菌数的对数值为纵坐标，做产气荚膜梭菌的生长曲线。同时以单独产气荚膜梭菌培养为对照，试验重复3次。1.2.5乳酸对益生菌液体储存性影响取上述益生菌发酵液，80 ℃热处理10 min，离心浓缩，采用饲料级乳酸调节其pH值为3.5，将其放于阴凉处，每隔1个月左右取适量的样品，进行十倍梯度稀释。丁酸梭菌计数方法为：取1 mL稀释液于空白试管中，加入8 mL冷却至55 ℃的DFS半固体培养基混匀，垂直放置20 min后，加入1 mL的灭菌甘油，37 ℃培养14 h，记录丁酸梭菌的菌数。枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌采用混板计数，其中枯草芽孢杆菌用LB培养基，37 ℃培养24 h，计数，凝结芽孢杆菌采用加富MRS培养基，42 ℃培养厌氧培养48 h，计数。2结果与分析2.1对产气荚膜梭菌有抑制作用的益生菌的初筛（见表1）由表1可知，枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌等发酵液对该指示菌具有抑制作用，其抑菌圈直径分别为16.67、14.54、15.72 mm。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.019.T001表1对产气荚膜梭菌具有抑制作用的益生菌初筛菌株抑菌圈直径/mm凝结芽孢杆菌14.54±0.09枯草芽孢杆菌16.67±0.13丁酸梭菌15.72±0.16鼠李糖乳杆菌—发酵乳杆菌—苏云金杆菌—菊糖芽孢杆菌—注：—表示对产气荚膜梭菌无抑制作用。2.2芽孢杆菌发酵液对产气荚膜梭菌最低抑菌浓度（见表2）由表2可知，饲料级乳酸调节梭菌培养用RCM培养基pH值为3.5，其对产气荚膜梭菌具有一定的抑制作用，MIC值为250 mg/g。产气荚膜梭菌对环境pH值高度敏感，在pH值低于5.1时，产气荚膜梭菌的增殖大大减少[6]。枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌发酵液的MIC分别为250、250、125 mg/g。当采用乳酸对其发酵液进行酸化处理后，其MIC分别为31.25、62.50、31.25 mg/g，远远低于空白对照的MIC（pH值为3.5 RCM培养基）。由此可见，枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌等对产气荚膜梭菌具有良好的抑制作用；乳酸的加入，对其抑菌作用具有协同作用。恩拉霉素的MIC值为0.005 mg/g，远低于益生菌发酵液的MIC值。后续将进一步探究益生菌的乳酸酸化发酵液对产气荚膜梭菌生长的影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.019.T002表2芽孢杆菌发酵液对产气荚膜梭菌的最低抑菌浓度发酵液MIC/(mg/g)枯草芽孢杆菌（乳酸，pH值3.5）31.250凝结芽孢杆菌（同上）62.500丁酸梭菌（同上）31.250枯草芽孢杆菌250.000凝结芽孢杆菌250.000丁酸梭菌125.000恩拉霉素0.005RCM培养基（乳酸，pH值3.5）250.0002.3乳酸酸化发酵液对产气荚膜梭菌生长的影响2.3.1乳酸酸化凝结芽孢杆菌发酵液对产气荚膜梭菌生长的影响（见图1）由图1可知，产气荚膜梭菌在培养约10 h进入对数生长期，约19 h进入稳定期，对数期持续约9 h。凝结芽孢杆菌发酵液经过乳酸酸化处理，其在浓度为62.50 mg/g时，可以完全抑制产气荚膜梭菌的生长；在31.25 mg/g浓度时，约10 h产气荚膜梭菌开始生长，但是增长趋势要弱于对照组，在约37 h仍未进入稳定期，整个对数期持续大于27 h，明显长于产气荚膜梭菌的9 h。由此可见，酸化凝结芽孢杆菌发酵液对产气荚膜梭菌具有良好的抑菌作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.019.F001图1乳酸酸化凝结芽孢杆菌发酵液对产气荚膜梭菌生长的影响2.3.2乳酸酸化枯草芽孢杆菌发酵液对产气荚膜梭菌生长的影响（见图2）由图2可知，对照组中产气荚膜梭菌在培养约6 h进入对数期，约24 h进入稳定期，对数期持续约18 h。62.50 mg/g的酸化枯草发酵液完全抑制其生长。酸化枯草芽孢杆菌发酵液在浓度为31.25 mg/g时，产气荚膜梭菌在培养26 h后，细胞数目无明显大量增加。其浓度为15.625 mg/g时，产气荚膜梭菌在培养约6 h进入对数期，其增长趋势弱于对照组。可见，酸化枯草芽孢杆菌发酵液对产气荚膜梭菌具有良好的抑制作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.019.F002图2乳酸酸化枯草芽孢杆菌发酵液对产气荚膜梭菌生长的影响2.3.3乳酸酸化丁酸梭菌发酵液对产气荚膜梭菌生长的影响（见图3）由图3可知，产气荚膜梭菌在培养约10 h进入对数增长期，19 h进入稳定期。浓度为2.50 mg/kg的恩拉霉素对产气荚膜梭菌具有一定的抑制作用，产气荚膜羧菌在培养13~37 h间均处于对数增长期，其增长趋势弱于产气荚膜梭菌组，但不能完全抑制其生长。酸化丁酸梭菌发酵液在浓度分别为62.50、31.25 mg/g时，均能完全抑制产气荚膜梭菌的生长，其抑制效果要优于2.50 mg/kg恩拉霉素。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.019.F003图3乳酸酸化丁酸梭菌发酵液对产气荚膜梭菌影响生长曲线2.4共培养芽孢杆菌对产气荚膜梭菌的影响2.4.1共培养枯草芽孢对产气荚膜梭菌生长的影响（见图4）枯草芽孢杆菌为好氧菌，产气荚膜梭菌为兼性厌氧菌，根据这两种菌的特性，经试验论证，在100 mLRCM肉汤（150 mL锥形瓶）中，两者均能很好地生长。产气荚膜梭菌能够利用偏重亚硫酸钠产生H2S，H2S和柠檬酸铁铵反应从而使菌落产生黑色特征菌落，用于产气荚膜梭菌的计数。由图4可知，单独培养的产气荚膜梭菌在RCM肉汤中培养至12 h时，其菌数呈稳定增长趋势，培养至24 h时，其菌数处于平稳期，直至24 h后，其菌数呈下降的趋势，但下降趋势缓慢。当产气荚膜梭菌和枯草芽孢杆菌共同培养12 h后，产气荚膜梭菌的生长呈快速下降的趋势，培养至48 h时，无法测定出产气荚膜梭菌的存在。在此期间，共同培养的枯草芽孢杆菌虽呈现出一定的下降趋势，但下降趋势较小。由此判断，在枯草芽孢杆菌和产气荚膜梭菌共同培养下，枯草芽孢杆菌能够抑制产气荚膜梭菌的生长。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.019.F004图4共培养时枯草芽孢杆菌对产气荚膜梭菌生长的影响注：A1为共同培养组产气荚膜梭菌菌数；A2为单独培养组的产气荚膜梭菌；B1为共同培养的枯草芽孢杆菌菌数；B2为单独培养的枯草芽孢杆菌菌数。2.4.2共培养凝结芽孢杆菌对产气荚膜梭菌生长的影响（见图5）凝结芽孢杆菌和产气荚膜梭菌均为厌氧菌，根据这两株菌的特性，经试验验证，两者在2 mL RCM肉汤的EP管（2 mL）中均能很好的生长。由图5可知，单独培养的产气荚膜梭菌在RCM肉汤中培养至24 h，其菌数呈稳定增长的趋势，培养至24 h后，其菌数呈下降的趋势，培养至72 h后，无法测出产气荚膜梭菌的存在。当产气荚膜梭菌和凝结芽孢杆菌共同培养时，其产气荚膜梭菌菌数变化趋势与单独培养的产气荚膜梭菌菌数变化趋势相近，但在培养的24~72 h内，共同培养的产气荚膜梭菌菌数下降趋势要大于单独培养的产气荚膜梭菌组。由此判断，凝结芽孢杆菌对产气荚膜梭菌生长有一定的抑制作用，但抑制效果较枯草芽孢杆菌对其生长的影响弱。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.019.F005图5凝结芽孢杆菌对产气荚膜梭菌生长的影响注：C1为共同培养组的产气荚膜梭菌；C2为单独培养组的产气荚膜梭菌。2.5乳酸对枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、丁酸梭菌发酵液储存稳定性的影响（见表3）枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌在极端条件下能够形成芽孢，增大其抗逆性。由表3可知，随着储存时间的延长，枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌芽孢菌数均呈现下降趋势，采用乳酸调节其pH值为3.5，可以增大其抑菌效果。但是，在pH值为3.5环境下，储存2个月后枯草芽孢杆菌由5.90×109 CFU/mL降低至1.96×109 CFU/mL，存活率仅为33.22%；凝结芽孢杆菌由3.00×107 CFU/mL降低至2.70×107 CFU/mL。丁酸梭菌由3.04×107 CFU/mL降低至3.07×104 CFU/mL其存活率仅为0.1%。丁酸梭菌是一种专性厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌为兼性厌氧菌，枯草芽孢杆菌为好氧菌。由此推测，在水环境中，芽孢存在大量萌发现象，同时氧的存在，导致厌氧菌大量死亡（丁酸梭菌死亡率最高），故仅采用低pH值达不到抑制液态芽孢萌发、维持发酵液稳定的效果。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.08.019.T003表3乳酸酸化发酵液稳定性观察储存时长/d枯草芽孢杆菌菌数/（CFU/mL）凝结芽孢杆菌菌数/（CFU/mL）丁酸梭菌菌数/（CFU/mL）05.90×1093.00×1073.04×107206.40×1094.76×1073.33×107601.96×1092.70×1073.07×1043讨论本研究筛选得到枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌对产气荚膜梭菌SA12具有抑制作用。阳艳林等[15]对市场上的7种常见枯草芽孢杆菌进行抑制产气荚膜梭菌的比较，结果表明，各个菌株之间的抑菌性能存在差异，枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径可达22 mm，与本研究结果一致，但是有的菌株并没有表现出抑制效果。进一步研究发现，即使同一菌株对不同血清型的产气荚膜梭菌的抑制效果也不尽相同，如PB6菌株对A型菌株的抑制效果要好于对C型菌株的抑制效果[15]。研究表明，将多种枯草芽孢杆菌进行复合，可以更好地预防NE的发生，同时更好地提高肉鸡的生产性能[16]。张玲等[17]研究发现，丁酸梭菌对产气荚膜梭菌具有抑制作用，可使其下降3~5个数量级，鼠李糖乳杆菌对其也具有一定的作用，与本研究结果不太相符，可能是存在菌株特异性的原因。郭双双[18]研究发现，嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌可以抑制产气荚膜梭菌生物膜的形成，降低相关炎症反应，抑制a毒素的分泌并且降解该毒素。夏亿等[19]在产气荚膜梭菌感染组日粮中添加以1×1010 CFU/（kg·d）的凝结芽孢杆菌，发现与感染组相比，试验组的平均日增重和日均采食量分别提高3.21%、2.00%。其肠损伤评分下降，绒隐比提高23.52%。魏晨阳等[14]研究发现，婴幼儿肠道的长双歧杆菌菌体与产气荚膜梭菌进行共培养时对其具有很好的抑制作用，其发酵上清液对产气荚膜梭菌的抑菌圈直径达16.9 mm。因此，考虑将不同种益生菌进行合理、科学的配伍以增强机体对NE感染的防御能力，降低家禽NE感染的严重程度。本研究发现，通过外源增加乳酸，可以提高各益生菌发酵液对产气荚膜梭菌的抑制作用。产气荚膜梭菌对环境pH值高度敏感，在pH值低于5.1时，产气荚膜梭菌的增殖大大减少[6]。因此，可以考虑复合，既能大量产生乳酸又能耐受高温制粒以及胃酸、胆盐等肠道恶劣环境的益生菌株，如凝结芽孢杆菌。本研究中，通过降低pH值来制造极端的酸性环境，试图达到抑制芽孢体的萌发。但是试验结果并没有达到理想效果，推测可能是代谢产物中还含有部分的营养成分，且在水环境中，芽孢体更易萌发。故对芽孢体的抑制，需要进一步研究。4结论枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌对产气荚膜梭菌均具有一定的抑制作用，但是调节其浓缩发酵液pH值为3.5，不能很好地抑制其芽孢萌发。建议采用合适生产工艺将枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌制成水溶性粉剂，以提高其储存性能。在现场使用时，配合乳酸，增大其对产气荚膜梭菌的抑制效果。