氨基酸是含有碱性氨基和酸性羧基的一类有机化合物，是构成生命体蛋白质的基本物质。蛋白质作为人体必需的营养物质，在人体内不能被直接利用，而是在胃肠道中经过多种消化酶的作用，将高分子蛋白质分解为低分子的氨基酸后被人体吸收[1]。氨基酸进入血液中与其输出速度几乎相等，使体内氨基酸代谢处于动态平衡。当摄入的蛋白质含量适宜时，蛋白质和氨基酸之间不断合成和分解形成一种平衡，从而达到机体的营养平衡状态。蛋白质突然增加或减少摄入量时，平衡机制会被破坏。如果持续时间过长，可能会导致体内抗体的死亡[2-3]。饲料作为畜禽动物摄入的食物，对其所含氨基酸含量的监测至关重要。检测氨基酸的方法有氨基酸分析仪法[4-5]、毛细管电泳检测紫外测定法、衍生-电位传感法[6-7]、高效液相色谱法[8-10]等。氨基酸分析仪法最为常见，但分析时长在1 h以上、检测效率低；毛细管电泳检测紫外测定法存在精度低、检测结果不准确的缺点；高效液相色谱法检测时长较长、需要柱前衍生、操作步骤烦琐。所以，建立一种能快捷准确的测定饲料中氨基酸含量的液相色谱-串联质谱法迫在眉睫。目前，已有液相色谱-串联质谱法（LC-MS）检测食品和保健品中的氨基酸含量[11-16]。本研究建立能同时测定不同种类的饲料中16种氨基酸的LC-MS方法，为饲料中氨基酸含量的测定提供技术参考。1材料与方法1.1试验仪器UltiMate 3000液相色谱系统（Thermo）、TSQ Quantiva质谱仪（Thermo）、MS205DU十万分之一天平（Mettler Toledo）、101-1A电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）、MTN-5800A氮吹仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）、涡轮混合器。1.2试验试剂16种氨基酸标准溶液（100 nmol/mL）购自德国曼默博尔公司；盐酸（优级纯）购自四川西陇科学有限公司；甲酸（色谱纯）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；购自甲醇（色谱纯）Sigma公司。6 mol/L盐酸溶液：500 mL盐酸和500 mL等比例混合；0.1%甲酸溶液：移取1.0 mL甲酸于1 000 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度。1.3试验方法1.3.1色谱条件色谱柱：Hypersil GOLD 50×2.1 mm，1.9 μm；柱温：40 ℃；流速：0.2 mL/min；洗脱程序见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.008.T001表1液相色谱洗脱程序Tab.1Liquid chromatography elution program时间/minA（0.1%甲酸溶液）B（甲醇）0.09552.09553.070304.070304.19556.09551.3.2质谱条件离子源：可加热电喷雾离子源（H-ESI）；扫描模式：正离子扫描；喷雾电压：3 500 V；鞘气：35 psi；辅助气：10 psi；离子传输管温度：350 ℃；源温度：300 ℃；16种氨基酸质谱多反应监测（SRM）参数见表2。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.008.T002表216种氨基酸质谱多反应监测（SRM）参数Tab.2Mass spectrometry multiple reaction monitoring (SRM) parameters of 16 amino acids项目母离子/（m/z）子离子/（m/z）扫描时间/ms碰撞电压/V去簇电压/V甘氨酸76.12530.35715.511.7030丙氨酸90.12544.22015.511.7430丝氨酸106.12560.16715.510.8632脯氨酸116.11270.08315.515.1533缬氨酸118.11272.15515.511.1130苏氨酸120.088103.07115.518.3164异亮氨酸132.16286.15515.510.3530亮氨酸132.16286.15515.510.3530天冬氨酸134.08874.08315.513.8539赖氨酸147.088129.33315.57.2336谷氨酸148.088102.05415.510.9860蛋氨酸150.050104.01215.510.5633组氨酸156.088110.16715.513.5540苯丙氨酸166.100120.08315.513.7235精氨酸175.11270.08315.522.8646酪氨酸182.050136.01215.512.79381.3.3标准工作溶液的配制准确移取1.2中的16种氨基酸标准溶液1.0 mL于10 mL棕色容量瓶中，用0.1%甲酸水溶液稀释并定容至刻度，配制成浓度为10 μmol/L的标准工作溶液。1.3.4样品前处理称取试样约100 mg，置于20 mL水解管中，加入6 mol/L的盐酸溶液10.0 mL，于氮气下充氮3 min，赶去管中空气，加盖；（110±2） ℃的电热鼓风干燥箱中水解24 h，取出冷却，摇匀，使用快速定性滤纸过滤至另一10 mL离心管中；量取0.1 mL样液于55 ℃下氮气吹干，按样品中氨基酸含量，加入1~10 mL的0.1%甲酸水溶液复溶，过0.22 μm水相滤膜后上机测定，上机溶液中各氨基酸含量应与标准工作溶液相近。2结果与分析2.1前处理过程的确定根据GB/T 18246—2019中的前处理过程，对部分操作进行适当优化，经过试验验证，水解管不需在冷冻环境下进行充氮操作，只需用氮气赶尽管中的空气，因此直接将水解管置于氮气下充氮3 min即可；水解后分取的样液仅为0.1 mL，可直接在氮气下吹干，对实验室内环境不会造成太大污染，样液在氮气下吹干后，使用适合质谱仪的0.1%甲酸水溶液进行复溶，能够减小溶剂效应对试验结果的干扰。2.216种氨基酸的线性方程和检出限（见表3）将1.2中的16种氨基酸标准溶液稀释成浓度在0.01~50.00 μmol/L的标准系列溶液，上机进行测定，以标准溶液浓度作为横坐标x（μmol/L），以峰面积作为纵坐标y建立标准曲线。由表3可知，16种氨基酸在0.01~50.00 μmol/L范围内线性良好，相关系数均大于0.990 0。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.008.T003表316种氨基酸的线性方程和检出限Tab.3Linear equations and detection limits of 16 amino acids项目线性方程相关系数（R2）检出限/(ng/g)甘氨酸y=58 820x+24 6700.992 610.0丙氨酸y=393 600x+120 6000.993 25.0丝氨酸y=527 000x+218 5000.990 85.0脯氨酸y=6 100 000x-206 7001.000 01.0缬氨酸y=4 040 000x+171 5000.999 91.0苏氨酸y=3 467 000x+58 8500.999 91.0异亮氨酸y=5 518 000x+121 3001.000 01.0亮氨酸y=5 054 000x+193 8000.999 91.0天冬氨酸y=341 500x+143 5000.991 15.0赖氨酸y=411 700x+131 9000.998 45.0谷氨酸y=195 800x+63 1000.994 55.0蛋氨酸y=1 321 000x+9 2370.999 91.0组氨酸y=4 450 000x+886 9000.998 91.0苯丙氨酸y=10 410 000x-54 6101.000 01.0精氨酸y=4 628 000x+359 1000.998 61.0酪氨酸y=2 047 000x+33 9900.999 91.0以3倍的性噪比（S/N）所对应的质量作为检出限，结果显示16种氨基酸所能达到的检测低限为1~10 ng/g。2.316种氨基酸的重复性测试（见表4）称取同一样品共6份，按照1.3.4前处理方法制备样液，在试验条件下进行测定，以出峰时间计算定性重复性，以氨基酸含量计算定量重复性。由表4可知，16种氨基酸的定性重复性在0.02%~0.12%之间，定量重复性在0.11%~0.94%之间，表明方法具有较好的精密度。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.008.T004表416种氨基酸的重复性测试（n=6）Tab.4Repeatability test of 16 amino acids (n=6)项目定性重复性定量重复性甘氨酸0.020.25丙氨酸0.120.47丝氨酸0.070.15脯氨酸0.050.11缬氨酸0.060.26苏氨酸0.050.54异亮氨酸0.020.52亮氨酸0.020.74天冬氨酸0.060.63赖氨酸0.040.35谷氨酸0.020.44蛋氨酸0.050.15组氨酸0.020.66苯丙氨酸0.040.47精氨酸0.050.94酪氨酸0.020.54%2.416种氨基酸的回收率测试（见表5）选用采购自美正公司的鱼粉质控样品，样品中16种氨基酸的量值及其扩展不确定度均为已知，按前处理过程处理试样，上机测定后计算回收率。由表5可知，16种氨基酸的回收率在97.3%~104.0%之间，实测结果与质控样标示量值的相对偏差均在2.0%以下，表明方法回收率良好。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.008.T005表516种氨基酸的回收率测试Tab.5Recovery rate test of 16 amino acids项目标示值实测果回收率相对差甘氨酸4.114.19101.91.0丙氨酸4.224.1698.60.7丝氨酸2.622.5798.11.0脯氨酸2.842.86100.70.4缬氨酸3.273.27100.00苏氨酸2.902.8899.30.3异亮氨酸2.832.83100.00亮氨酸4.894.8499.00.5天冬氨酸6.086.09100.20.1赖氨酸5.255.2499.80.1谷氨酸8.688.84101.80.9蛋氨酸2.122.1099.10.5组氨酸2.002.08104.02.0苯丙氨酸2.742.76100.70.4精氨酸3.853.85100.00酪氨酸2.202.1497.31.4%2.5实际样品测定结果选用配合饲料、浓缩饲料、鱼粉、肉粉等不同种类的样品共8份，采用GB/T 18246—2019与本方法同时对8份样品中16种氨基酸进行测定，结果表明，16种氨基酸的相对偏差均在5%以内，证明本方法测得结果准确可靠。3结论研究基于液相色谱-串联质谱仪定性准确、检测效率高等特点，通过优化样品前处理过程和液相色谱-质谱条件，建立能够同时测定饲料中16种氨基酸的检测方法。本方法处理过程简单、易操作，经试验证实检出限低、灵敏度高、精密度良好、回收率、准确度高。与检测用时较长的氨基酸分析仪相比，能够缩短分析时间、提高检测效率。研究为饲料中16种常规氨基酸含量的检测提供参考。