山豆根为豆科植物越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep.）的干燥根和根茎，性味苦寒、归肺、胃经，具有清热解毒、消肿利咽的功效[1-2]。山豆根主要活性成分有多糖、黄酮、生物碱、皂苷等[3-4]。山豆根多糖（Sophora subprostrate polysaccharide，SSP）是从山豆根中提取得到的总多糖。山豆根多糖具有清除自由基、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和免疫调节的作用[5-8]。目前，山豆根多糖提取工艺有水提醇沉法、微波萃取法和超声波提取法[9-11]。水提法操作简单，但提取得率较低。超声波和微波提取对设备要求较高，且对人体有一定的危害[12]。酶解法与其他提取法相比，反应条件温和、提取得率高、操作简单、成本低、对设备要求不高。木瓜蛋白酶热稳定性高、酶活性高，是极具研究价值的提取用酶。本试验采用木瓜蛋白酶酶解法提取山豆根多糖，并优化其提取工艺条件，为山豆根多糖药理学研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1药品及试剂山豆根（广西玉林市祥生中药饮片有限责任公司）、木瓜蛋白酶（酶活力≥6 000 U/mg，上海国药集团化学试剂公司）、纳氏比色管（天津市天科玻璃仪器制造有限公司）、氢氧化钠、浓硫酸、碱性酒石酸铜、硫代硫酸钠、磺基水杨酸、淀粉指示剂、95%乙醇、苯酚试剂等均为国产分析纯。1.1.2仪器设备FW177中药粉碎机（天津泰斯特仪器公司）、RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、FD-1-50真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器公司）、UV-1800紫外可见光分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）。1.1.3试剂配制碱性酒石酸铜试液配制：称取硫酸铜结晶6.93 g，加水使溶解成100 mL；称取酒石酸钾钠结晶34.6 g与氢氧化钠10 g，加水使溶解成100 mL。试验时将两种溶液等量混合。硫化钠试液配制：称取硫化钠1 g，加水使溶解成10 mL。1.2试验方法1.2.1木瓜蛋白酶法提取山豆根粗多糖称取粉碎的山豆根4 g，按1∶15加入蒸馏水60 mL，浸泡30 min。调节pH值，加入木瓜蛋白酶，充分混匀，置于水浴中反应。过滤，残渣中加入60 mL蒸馏水，沸水浴1.5 h。过滤，合并两次滤液，蒸馏浓缩，加入5倍量的95%乙醇，充分混匀，低温静置过夜（12 h以上）；取上清液，离心（3 000 r/min、10 min），取沉淀加蒸馏水溶解（1∶5），静置，离心（3 000 r/min、10 min），取上清液，加入5倍量95%乙醇沉淀，低温静置过夜；离心（3 000 r/min，10 min），沉淀部分加入95%乙醇搅拌，离心去乙醇，置于-20 ℃冰箱12 h以上，放入冷冻干燥机中干燥，得山豆根粗多糖，计算粗多糖得率。1.2.2标准曲线的绘制称取20 mg葡聚糖，置于500 mL容量瓶中，制成葡聚糖储备液。分别取标准葡聚糖储备液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL置试管中，每管加水至总体积为2.0 mL，各试管再加1.0 mL 6%苯酚试剂，混匀；加入5.0 mL浓硫酸，静置5 min，沸水中加热15 min，转入冷水冷却至室温。另以蒸馏水2.0 mL，如上操作设为空白对照，在吸收波长620 nm处测定吸光度值，以吸光度为横坐标，葡聚糖质量为纵坐标，绘制标准曲线。求得线性回归方程：y=163.43x+3.059 9，其中y为葡聚糖质量，x为吸光度，相关系数R2=0.992 8。1.2.3山豆根多糖总糖含量测定称取5 mg山豆根粗多糖，置于100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容到刻度线。吸取1.0 mL，加苯酚硫酸试剂6.0 mL，按标准曲线绘制的操作，测定吸光度，得山豆根多糖的吸光度为0.252，代入1.2.2线性回归方程，计算山豆根多糖总糖含量。1.2.4单因素试验1.2.4.1酶解浓度对山豆根多糖得率的影响酶解条件设定为酶解温度50 ℃、pH值5、酶解时间2 h，分别采用0.1%、0.5%、1.0%、2.0%和4.0%酶解浓度进行提取。每组酶浓度做3个平行，取平均值。计算山豆根多糖得率。1.2.4.2酶解温度对山豆根多糖得率的影响酶解条件设定为酶解浓度2.0%、pH值5.0、酶解时间2.0 h，分别采用40、45、50、55、60 ℃酶解温度进行提取，每组酶解温度做3个平行，取平均值。计算山豆根多糖得率。1.2.4.3酶解pH值对山豆根多糖得率的影响酶解条件设定为酶解浓度2.0%、酶解温度55 ℃、酶解时间2.0 h、分别采用pH值为5、6、7、8、9的条件进行提取，每组pH值做3个平行，取平均值。计算山豆根多糖得率。1.2.4.4酶解时间对山豆根多糖得率的影响酶解条件设定为酶解浓度2.0%、酶解温度55 ℃、pH值5，分别采用1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h酶解时间进行提取，每组酶解时间做3个平行，取平均值。计算山豆根多糖得率。1.2.5正交试验设计根据单因素试验结果，按照4因素3水平进行L9（34）试验，确定提取山豆根多糖的最佳参数。正交试验因素与水平设计见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.001.T001表1L9（34）正交试验因素与水平设计Tab.1L9（34） orthogonal test factors and level design水平因素A酶浓度/%B酶解温度/℃C酶解时间/hD酶解pH值11502.0522552.5634603.071.2.6山豆根多糖酶法提取工艺验证试验在正交试验得出的最佳条件下重复多糖提取和测定多糖含量（1.2.1、1.2.2和1.2.3）。同时采用水提醇沉法提取山豆根多糖。具体操作如下：称取山豆根300 g，加入15倍蒸馏水于沸水中提取3次，每次1.5 h，3次提取液合并，并浓缩至300 mL，剩余步骤同上述酶解法。2结果与分析2.1单因素对山豆根多糖提取率的影响2.1.1木瓜蛋白酶浓度对山豆根多糖得率的影响（见图1）由图1可知，当木瓜蛋白酶的浓度小于2%时，随着酶浓度的上升，多糖得率升高；当浓度超过2%时，多糖得率逐渐下降。因此，木瓜蛋白酶的最适提取浓度是2%。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.001.F001图1木瓜蛋白酶浓度对山豆根多糖得率的影响Fig.1The effect of papain concentration on the yield of SSP2.1.2酶解温度对山豆根多糖得率的影响（见图2）由图2可知，随着温度升高，多糖得率稍有降低，继而升高。当达到55 ℃时，多糖得率达到最大。温度继续升高，多糖得率下降。因此，木瓜蛋白酶酶解最适温度为55 ℃。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.001.F002图2酶解温度对山豆根多糖得率的影响Fig.2The effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of SSP2.1.3pH值对山豆根多糖得率的影响（见图3）由图3可知，当pH值为5时，多糖得率达到最高。因此，木瓜蛋白酶酶解的最适pH值为5。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.001.F003图3pH值对山豆根多糖得率的影响Fig.3The effect of pH value on the yield of SSP2.1.4酶解时间对山豆根多糖得率的影响（见图4）由图4可知，随着酶解时间的增加，多糖得率先升高后降低再升高，当酶解时间为3 h时，多糖得率达到最高。因此，木瓜蛋白酶酶解的最适时间为3 h。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.001.F004图4酶解时间对山豆根多糖得率的影响Fig.4The effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of SSP2.2木瓜蛋白酶提取山豆根多糖正交试验结果（见表2）通过单因素试验，初步优化条件为酶浓度2%、酶解温度55 ℃、pH值5、酶解时间3 h。在此基础上设计正交试验。由表2可知，不同因素对山豆根多糖含量影响的顺序为：酶浓度＞酶解温度＞酶解时间＞酶解pH值，最佳工艺条件为A3B3C1D1，即酶浓度2%、酶解温度55 ℃、酶解时间3 h、酶解pH值5。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.001.T002表2正交试验结果Tab.2Orthogonal test results试验号因素多糖得率/%ABCD111111.357 5212221.282 5313331.522 5421231.682 5522311.790 0623122.195 0731321.577 5832131.915 0933212.252 5K14.162 54.617 55.467 55.400 0K25.667 54.987 55.217 55.055 0K35.745 05.970 04.890 05.120 0R1.582 51.352 50.577 50.345 02.3验证试验结果酶解工艺最优条件下，木瓜蛋白酶提取山豆根粗多糖得率为5.11%，总糖含量达88.48%，水提法得率为3.54%，木瓜蛋白酶提取法得率是水提法得率的1.4倍。3讨论山豆根多糖具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和清除自由基等作用，是极具研究价值的中草药活性成分。酶解法是多糖提取的主要方法之一，具有提取得率高、安全可靠等特性。但是，目前对山豆根多糖的研究较少。木瓜蛋白酶具有热稳定性高、酶活性高、安全可靠等优点[12]，在荸荠皮多糖、枸杞多糖、五味子多糖、辣木多糖、灵芝多糖等中药多糖提取中广泛应用[13-17]，提取效果较好。本试验以山豆根为原料，采用木瓜蛋白酶酶解法提取多糖，在最佳工艺下山豆根粗多糖得率为5.11%，总糖含量达88.48%。许海棠等[18]研究发现，水提法得率为3.98%。帅学宏[19]研究发现，水提法得率为3.26%，总糖含量为56.74%，与酶解法相比水提醇沉法得率明显偏低且提取时间较长。徐建平等[9]研究发现，微波提取法得率为3.27%。彭湘君等[20]研究发现，微波提取法得率为3.62%，与酶解法相比微波提取法得率偏低，设备要求高。赖红芳等[10]研究发现，超声波提取得率为6.08%。超声波提取法虽然得率有所提高，但对设备要求高、经济成本高、对人体有一定的伤害。单因素试验结果表明，过高的温度并不能提高多糖得率，随着温度升高，反应物能量增加，使反应速度加快；但当超过其最适温度后，酶蛋白质变性，使得酶活力减弱，反应速度也随着温度的升高迅速下降。酶解pH值为9多糖得率较高，略低于pH值为5的得率，因为碱性环境有利于多糖的浸出。但pH值过高导致酶的活性降低。酶只有在一定的pH值时，其活性才会达到最高。偏离该值，无论pH值是增加或减少，酶的活性均会下降，进而导致多糖得率下降。汪建红等[13]、薛俊礼等[15]和丁霄霄等[17]研究表明，木瓜蛋白酶提取多糖或者含有木管蛋白酶的复合酶提取多糖pH值均在5左右，与本试验结果一致。通过与水提法的比较可知木瓜蛋白酶能提高山豆根多糖提取得率，缩短提取时间，为山豆根多糖进一步研究奠定基础。目前，多糖提取已有微波辅助酶解法[15]和复合酶提取法[17]。木瓜蛋白酶酶解法可以和其他酶复合使用或者与微波法联合提取山豆根多糖，进一步优化提取工艺，获得更高得率的山豆根多糖提取方法。4结论本试验通过单因素试验和正交试验，得出影响山豆根多糖得率指标的因素大小顺序为酶浓度酶解温度酶解时间酶解pH值，最佳工艺条件为酶浓度2%、酶解温度55 ℃、酶解时间3 h、酶解pH值5。