酮病是奶牛常见的一种群发性代谢病，是围产期奶牛因能量负平衡（NEB）导致糖和脂代谢出现紊乱的一种现象，常发生于妊娠晚期和泌乳早期[1-2]。酮病的发病率在高产奶牛中达30%以上。酮症的发病率已超过瘤胃酸中毒和奶牛热的发病率。酮病主要动员机体脂肪组织中长链脂肪酸，这些脂肪酸在肝脏中被氧化成酮体。脂肪组织中的甘油三酯进行脂解，释放大量游离或非酯化脂肪酸（NEFA）进入血液循环。一般NEFA在肝脏中酯化，并以低密度脂蛋白胆固醇（VLDL-C）传递到全身的循环中[3]。但是，如果NEFA的数量超过肝脏的酯化能力，就会在肝细胞线粒体中不完全氧化最终形成酮体，导致β-羟基丁酸（BHBA）升高，导致酮病发生[4]。酮病在临床中会导致奶牛的泌乳量及乳质量下降，使其经济价值造成巨大损失。因此，本试验旨在确定围产期奶牛体况、血液生化指标与酮病的关系，并作出风险预警。1材料与方法1.1试验动物与试验设计本试验在黑龙江省某集约化牧场进行。试验奶牛均为中国荷斯坦奶牛。试验选取94头胎次相近的围产期奶牛进行跟踪调查，通过检测试验奶牛分娩当天、产后7 d与产后14 d血浆BHBA水平，将产后7 d和产后14 d血浆BHBA浓度都超过1.2 mmol/L确定为酮病组（K组，n=52），低于1.2 mmol/L确定为对照组（C组，n=42），试验奶牛均按照中国奶牛饲养标准饲喂全混合日粮（TMR），试验期间自由饮水。1.2测定指标及方法选择围产期奶牛94头，分别在分娩当天、产后7 d和产后14 d，根据奶牛体况评分标准（5分制）利用BCSCowdition软件对奶牛进行体况评分，并通过牧场饲养管理系统采集奶牛泌乳信息。同时，在分娩当天（0 d）、产后7 d和产后14 d清晨对试验奶牛进行尾根静脉采血20 mL，注入肝素抗凝管，低转速离心机以4 000 r/min离心10 min，取上层清液，用高速离心机12 000 r/min离心5 min，试验样品-80 ℃下保存至生化检测。血液指标检测：葡萄糖（Glu）以葡萄糖氧化酶法检测；β-羟丁酸（BHBA）采用化学法检测；游离脂肪酸（NEFA）通过比色法检测；谷草转氨酶（AST）采用速率法检测；甘油三酯（TG）采用酶法检测；总胆固醇（TC）采用化学法检测；钙（Ca）使用邻甲酚酞络合酮法检测检；镁（Mg）使用偶氮胂Ⅲ比色；磷（P）采用孔雀绿比色法；钾（K）采用蛋白水解酶法检测。1.3数据统计与分析使用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，数据以“平均值±标准差”表示。采用GLM模式对两组试验奶牛血浆生化指标及泌乳水平进行分析，其中包括时间效应（T）和组间效应（G），以及时间与组间的交互效应（T×G）。通过皮尔逊相关系数对存在显著性差异指标进行相关性分析。建立二元Logistic回归来模拟各项指标对试验奶牛酮病的预测性，采用受试者工作曲（ROC）分析风险预警效果及最佳预警值。P0.05表示显著性差异，P0.01表示极显著差异。2结果与分析2.1试验奶牛的体况分析（见表1）由表1可知，两组奶牛在分娩当天、产后7 d的体况存在极显著差异（P0.01），在产后14 d的体况存在显著差异（P0.05），并且分娩到产后14 d的体况损失存在极显著差异（P0.01）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.016.T001表1试验奶牛的体况分析Tab.1Body condition analysis of experimental dairy cows项目BCS/分0~14 d BCS损失/分0 d7 d14 dP值0.0000.0070.0220.000K组3.92±0.33A3.66±0.40A3.39±0.35a0.58±0.27AC组3.57±0.24B3.37±0.32B3.29±0.35b0.31±0.25B注 ：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05），无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2试验奶牛的泌乳水平（见表2）由表2可知，产后7 d，K组奶牛的日均泌乳量极显著低于C组奶牛（P0.01），在产后14 d，K组奶牛的日均泌乳量显著低于C组奶牛（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.016.T002表2试验奶牛的泌乳水平Tab.2Lactation performance of experimental dairy cows组别日均泌乳量/kg7 d14 dK组26.64±8.32By30.16±13.26bxC组31.08±7.53Ay35.23±9.32axP值T0.040G0.009T×G0.001注 ：同行数据肩标X、Y、Z表示差异极显著（P0.01），x、y表示差异显著（P0.05），无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.3试验奶牛能量代谢水平（见表3）由表3可知，在分娩当天，K组血浆中Glu与C组无显著差异（P0.05），BHBA、NEFA含量与C组存在极显著差异（P0.01）。在产后7 d，K组血浆中Glu含量显著低于C组（P0.05），BHBA、NEFA含量极显著高于C组（P0.01）。在产后14 d，K组血浆中Glu含量极显著低于C组（P0.01），BHBA、NEFA含量极显著高于C组（P0.01）。在分娩当天到产后14 d，K组奶牛血浆中Glu含量极显著下降（P0.01），BHBA、NEFA含量极显著升高（P0.01）。C组奶牛Glu含量显著下降（P0.05），NEFA含量显著升高（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.016.T003表3试验奶牛能量代谢的水平Tab.3Energy metabolism levels of experimental dairy cows项目GluBHBANEFA0 d7 d14 d0 d7 d14 d0 d7 d14 dK组3.99±1.15X3.38±0.79bY3.07±0.72BY0.81±0.27AX1.24±0.17AY1.32±0.19AY0.79±0.04AX1.29±0.24AY1.31±0.20AYC组4.22±1.12x3.87±0.90a3.51±0.74Ay0.58±0.30B0.64±0.30B0.70±0.19B0.77±0.04Bx0.84±0.16By0.85±0.12ByP值T0.0000.0000.000G0.0120.0000.000T×G0.7440.0000.000mmol/L2.4试验奶牛肝功水平（见表4）由表4可知，在产后7 d，K组血浆中AST活性、TC含量与C组存在显著差异（P0.05）。产后14 d，K组血浆中AST活性显著高于C组（P0.05），TC含量极显著高于C组（P0.01）。在分娩当天到产后14 d，K组血浆中TG含量极显著高于C组（P0.01）。两组奶牛血浆中AST活性极显著上升（P0.01），然后下降。两组奶牛血浆中TC含量在分娩到产后7 d极显著升高（P0.01），TC含量在分娩到产后14 d极显著升高（P0.01）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.016.T004表4试验奶牛血浆肝功水平Tab.4Plasma levels of liver function of experimental dairy cows项目AST/(U/L)TC/(mmol/L)TG/(mmol/L)0 d7 d14 d0 d7 d14 d0 d7 d14 dK组90.95±32.31Y127.75±37.73aX101.90±28.85aY1.52±0.55Y2.59±1.00aX3.09±1.13AX0.17±0.02AY0.18±0.02AY0.19±0.04AXC组87.10±31.36Y107.28±48.70bXx89.55±21.73by1.33±0.49Z2.15±0.79bY2.39±1.06BX0.14±0.01BY0.16±0.01BY0.16±0.01BXP值T0.0000.0000.000G0.0000.0000.000T×G0.0600.1810.4942.5试验奶牛血浆矿物质元素水平（见表5、表6）由表5、表6可知，K组奶牛血浆中K、Ca、Mg和P的含量与C组无显著性差异（P0.05）。在分娩当天到产后14 d，两组组奶牛血浆中Ca含量极显著下降（P0.01）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.016.T005表5试验奶牛血浆K、Ca水平Tab.5Plasma K and Ca levels of experimental dairy cows项目KCa0 d7 d14 d0 d7 d14 dK组4.09±0.484.03±0.503.97±0.222.98±0.21X2.67±0.27Y2.70±0.12YC组4.02±0.523.97±0.344.01±0.412.95±0.22 X2.69±0.29Y2.71±0.23YP值T0.7410.001G0.5880.471T×G0.4640.346mmol/LXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.016.T006表6试验奶牛血浆Mg、P水平Tab.6Plasma levels of Mg and P of experimental dairy cows项目MgP0 d7 d14 d0 d7 d14 dK组0.83±0.100.83±0.090.82±0.101.99±0.321.86±0.191.89±0.51C组0.83±0.130.81±0.170.80±0.081.86±0.391.83±0.281.85±0.47P值T0.4010.278G0.5730.199T×G0.2740.740mmol/L2.6奶牛酮病的预警评估（见表7、表8、图1）由表7可知，奶牛BCS、血浆BHBA、NEFA、TG与奶牛酮病显著正相关（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.016.T007表7奶牛分娩当天BCS、血液检测指标与酮病的相关性Tab.7Correlation between BCS, blood test indexes and ketosis in dairy cows on the day of delivery（n=104）项目BHBA/(mmol/L)NEFA/(mmol/L)TG/(mmol/L)BCS/分均值0.68±0.310.78±0.410.15±0.023.78±0.34R值0.728**0.797**0.436**0.646**P值0.0030.0080.0000.000注 ：“*”表示显著相关（P0.05）；“**”表示极显著相关性（P0.01）。使用二元Logistic回归模型模拟分娩当天指标对奶牛酮病预测性。奶牛BCS、血浆BHBA和NEFA可预测奶牛酮病。由表8、图1可知，通过Youden指数确定奶牛酮病相关指标BCS的最佳分界值为3.625，敏感度为88.1%，特异度为54.6%；奶牛血浆BHBA的最佳分界值为0.68 mmol/L，敏感度为72.9%，特异度为74.4%；血浆NEFA的最佳分界值为0.78 mmol/L，敏感度为69.5%，特异度为71.8%。BCS、BHBA和NEFA的ROC曲线下面积分别为0.796、0776和0.676，具有一定的诊断意义。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.016.T008表8奶牛酮病诊断的BCS、BHBA、NEFA的分界值、敏感度、特异性、标准误及ROC曲线下面积Tab.8The cutoff point, sensitivity, specificity, standard error, and area under the ROC curve of BHBA, NEFA and BCS diagnosed by ketosis项目BHBA/(mmol/L)NEFA/(mmol/L)BCS/分分界值0.680.783.625Youden指数0.4730.4130.445敏感度/%72.969.588.1特异性/%74.471.854.6标准误0.0400.0470.040曲线下面积0.7760.6760.796XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.016.F001图1酮病奶牛BCS、血浆BHBA、NEFA诊断的曲线下面积Fig.1Area under curve of BCS, BHBA and NEFA in ketosis cows3讨论3.1体况对奶牛酮病的影响奶牛体况的变化会影响其代谢能力。体况损失可能通过血液代谢物浓度的改变对奶牛的生化指标[5]，会增强围产期奶牛的血浆活性氧、活性硫巴比妥酸前体和硫醇基团活性，并降低血浆超氧化物歧化酶活性。奶牛营养不良会影响机体的生理、生化指标[6]。高的BCS能够增加奶牛患酮病的风险[7]。能量缺乏，奶牛处于低血糖状态，脂肪加速分解。脂肪的过度动员导致血液中NEFA含量升高[8]。循环中的NEFA可以在肝细胞中氧化或作为极低密度脂蛋白胆固醇（VLDL-C）的组成部分。然而，NEFA的产生超过肝脏的能量需求和氧化能力，导致酮体的产生[9-10]。当肝脏的代谢效率不足时，在血液、尿液或牛奶中可以发现酮体，并且过量的NEFA和BHBA还对机体的免疫细胞功能产生负面影响。3.2泌乳性能对奶牛酮病的影响能量储备过多或过少对奶牛都有负面影响，是降低奶牛产奶量的风险因素。高产奶牛在泌乳早期不能通过摄取饲料来满足能量需求，随着能量储备的调动和干物质摄入量的减少，导致NEB的发生[11]，从而发生酮病，伴随长时间抑制采食。能量补充不足，导致生产性能不佳。繁殖和疾病问题也是影响奶牛泌乳性能的主要因素。酮病奶牛在泌乳早期BCS损失过多会有不规则的体温，致使第1次排卵的时间更长，而且可能无法受孕，这使奶牛以后胎次泌乳量会受到更严重影响[12]。3.3血液指标对奶牛酮病的影响血浆AST活性反映肝功情况，提示肝细胞损伤及其损伤程度，尤其是在脂肪肝综合征、肝炎、肝硬化时，血浆AST活性将会大幅升高。高BCS损失奶牛具有较高的循环AST活性，表明肝脏已经受损。本试验中，酮病奶牛呈现高活性AST的特征。Vargová等[13]报道，奶牛AST活性升高与较低的采食量和酮症有关，与本试验结果一致。本试验中，酮病奶牛呈现高血浆BHBA、NEFA、TC、TG和低Glu的生化特征，产后7~14 d血浆BHBA、NEFA、TC、TG、Glu、AST变化更为剧烈。脂肪组织代表身体的主要能量储备，奶牛脂解和脂肪生成不断发生，因此产生NEFA。当过度动员脂质储备，奶牛NEFA、TC、TG含量会随之上升，NEFA代谢产生乙酰辅酶A，肝细胞将过量的乙酰辅酶A通过β氧化转化为酮体，当不完全氧化时，血浆BHBA随之上升。Cincovic等[14]报道，奶牛泌乳早期的脂肪动员会导致Glu下降，NEFA和BHBA浓度升高。奶牛血浆NEFA、TC升高和Glu下降趋势表明NEB状态更严重[15]，这在一定程度上解释了在本试验中酮病奶牛体内这些代谢物的异常浓度。酮病奶牛经历过度的脂肪动员和长时间的NEB，影响免疫系统的功能。4结论本试验中，确定围产期奶牛BCS及血浆BHBA、NEFA、TG与奶牛酮病存在强相关性，分娩当天BCS3.625、奶牛血浆BHBA0.68 mmol/L、血浆NEFA0.78 mmol/L时，奶牛有患酮病的风险。