仔猪大肠杆菌性腹泻是由产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）引起的急性传染病。大肠杆菌利用菌毛上的抗原（又称为黏附素）与仔猪小肠上皮细胞上的受体结合，吸取肠道内的营养物质大量繁殖，并产生肠毒素而导致强烈的腹泻。大肠杆菌（ETEC）的主要致病因子是黏附素和肠毒素[1-4]。目前，已从猪源大肠杆菌中发现K88（F4）、K99（F5）、987P（F6）、F18、F41、F42、F107等多种菌毛[5-8]。肠毒素包含耐热肠毒素（ST）和不耐热肠毒素（LT）。ST1能够使小肠绒毛上皮细胞内环磷酸鸟苷（cGMP）升高10倍，而且该毒素有组织特异性[9-11]。LT由A亚单位和B亚单位组成，全LT或B亚单位均具有良好的免疫原性。LTA亚单位是大肠杆菌（ETEC）毒素的活性部位，LTB亚单位负责与GMl神经节苷脂糖蛋白受体结合，产生功能性细孔。LTA亚单位则由孔进入，激活胞浆内的腺苷酸环化酶（AC），环磷酸腺苷（cAMP）含量增加，引起肠道内环境改变，从而导致腹泻[12-13]。ECET腹泻的药物治疗已经使菌株产生耐药性。目前常使用疫苗免疫接种的方式来预防、控制新生仔猪的大肠杆菌性腹泻。目前，应用的疫苗主要有K88-K99-987P、K88-LTB和K88-K99等基因工程亚单位疫苗[14-15]。本课题组构建重组菌株BL21(DE3)(pXK88acST1LTB)[16-17]。该重组菌株在保留K88ac和LTB原有抗原性的基础上，使原本不具有抗原性的ST1被赋予抗原性，并丧失ST1肠毒素的活性；并采用控制不同单因素变量的方法，探索K88ac-ST1-LTB三价基因工程疫苗菌株最适的培养方法，确定最佳培养条件，并进行灭活试验，从而为ETEC疫苗的成功研制和生产提供参考。1材料与方法1.1试验菌株基因工程菌株BL21(DE3)(pXK88acST1LTB)由许崇波等[15]构建。1.2试验试剂肉汤培养基：20.0 g蛋白胨、5.0 g牛肉粉、5.0 g氯化钠，加蒸馏水定容到1 000 mL，调pH值至7.5。LB培养基：5.0 g酵母粉、10.0 g氯化钠、10.0 g胰蛋白胨，加蒸馏水定容到1 000 mL。改良LB培养基：5.0 g酵母粉、8.0 g胰蛋白胨、5.0 g牛肉膏、5.0 g NaCl，加蒸馏水定容到1 000 mL。制备好的3种培养基需要分别添加一定量的消泡剂。2 mol/L氢氧化钠调pH值至7.4~7.6，高压灭菌20 min。IPTG、聚丙烯酰胺等购自南京海克尔生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母粉购自上海新睿生物科技有限公司；牛肉膏、葡萄糖、氯化钠、氢氧化钠购自赫澎（上海）生物科技有限公司。1.3菌株最佳培养条件试验1.3.1最佳培养基的筛选将制备的LB、改良LB和普通肉汤培养基分别添加至发酵罐，每罐10万mL，2％比例接种大肠杆菌菌株的种子液，37 ℃通气培养6 h后，加入葡萄糖溶液至终浓度0.2%，继续培养16 h进行活菌计数。每种培养基重复进行3次试验，记录每种培养基的菌数，并计算平均值（CFU/mL）。1.3.2最佳诱导剂的筛选4个发酵罐分别加入改良LB培养基，每罐为10万mL，按照2％比例接种菌株的种子液，37 ℃通气培养4~6 h后，加入终浓度为0.2%葡萄糖补充碳源，继续培养4 h后，每罐分别加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG、1.0 mmol/L的乳糖、10.0 mmol/L的乳糖、100.0 mmol/L的乳糖进行诱导，诱导4 h，每罐取1 mL菌液进行SDS-PAGE分析并检测目的蛋白表达量。1.3.3乳糖最佳诱导条件的筛选按照2％比例接种种子液于发酵罐中，37 ℃培养4~6 h，加入终浓度为0.2%葡萄糖补充碳源，继续通气培养4 h，加入终浓度为100 mmol/L乳糖诱导6 h，期间每隔1 h取1 mL菌液进行活菌计数，同时SDS-PAGE检测目的蛋白表达量。1.3.4最佳通气量培养条件的筛选按照2%比例分别接种大肠杆菌BL21(DE3)(pXK88acST1LTB)菌株的种子液至3个发酵罐，每罐10万mL，3个罐的通气量分别为50、100、500 L/min。37 ℃培养6 h后，加入终浓度0.2%的葡萄糖补充碳源，继续培养4 h，加入终浓度为100 mmol/L的乳糖诱导6 h，取1 mL菌液进行活菌计数，同时SDS-PAGE检测目的蛋白表达量。试验重复3次。1.4灭活试验取3罐菌数在1.15×1010~1.23×1010 CFU/mL的大肠杆菌菌液，每罐分成9份，共27份。将27份菌液随机分成3组，每组9份。将9份菌液分为3组，每组3份，每组分别加入终浓度为0.4％、0.6％和0.8％的甲醛溶液37 ℃灭活。灭活时间分别为12、24、48 h。灭活的过程中，需要振摇菌液数次，以保证菌液的彻底灭活。2结果与分析2.1不同培养基对菌株生长的影响（见表1）由表1可知，配置的3种培养基对细菌生长影响较大，其中改良LB培养基、普通肉汤培养基的细菌数目极显著高于LB培养基（P0.01）。从菌株培养环境的稳定性和降低工业化生产成本角度来说，改良LB培养基是最适宜培养基。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.002.T001表1不同培养基对菌株生长的影响Tab.1The influence of different media on the growth of strains组别培养基批次活菌/(×109 CFU/mL)平均菌数/(×109 CFU/mL)试验组ⅠLB018.918.46±0.69027.85038.63试验组Ⅱ改良LB0111.6011.11±3.21**0210.430311.31试验组Ⅲ普通肉汤0111.9211.45±0.41**0210.840311.61注 ：“**”表示与LB培养基相比，具有极显著差异（P0.01）。2.2不同诱导剂对菌株生长的影响（见图1、表2）由图1、表2可知，分别使用IPTG和乳糖进行诱导表达，100 mmol/L乳糖和1 mmol/L IPTG诱导效果最较好，GDS-8000凝胶成像分析系统软件分析表明，二者表达量分别为29.43%和33.24%，考虑生产成本，宜选用乳糖作为诱导剂。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.002.F001图1IPTG与乳糖诱导的试验结果Fig.1The induced test results of IPTG and lactose注 ： 1为1mmol/L IPTG BL21（DE3）（pxK88acST1LTB）细胞裂解液；2为1 mmol/L乳糖BL21（DE3）（pxK88acST1LTB）细胞裂解液；3为10 mmol/L乳糖BL21（DE3）（pxK88acST1LTB）细胞裂解液；4、5为100 mmol/L乳糖BL21（DE3）（pxK88acST1LTB）细胞裂解液；M为低分子量蛋白Marker。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.002.T002表2不同诱导剂对菌株生长的影响Tab.2The effect of different inducers on the growth of strains诱导剂种类终浓度/(mmol/L)目的蛋白表达量/%IPTG133.24乳糖18.26乳糖1026.37乳糖10029.432.3乳糖不同诱导时间对菌株生长的影响（见表3、图2）由表3、图2可知，随着诱导时间的增加，pH值先降低后升高，总菌数和蛋白表达量也在相应增多。当诱导时间为6 h时，蛋白表达达到最大值。GDS-8000凝胶成像分析系统软件分析表明，蛋白表达量为30.02%。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.002.T003表3乳糖不同诱导时间对菌株生长的影响Tab.3The effect of different induction time of lactose on the growth of strains培养时间/h诱导后时间/hpH值活菌计数/(×109 CFU/mL)1007.709.711227.5011.251337.2012.601447.2012.421557.5012.111667.7011.34XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.002.F002图2不同诱导时间对目的蛋白表达的影响Fig.2Effects of different induced time on the expression of the target protein注 ： 1为诱导1 h BL21（DE3）（pxK88acST1LTB）细胞裂解液；2为诱导2 h BL21（DE3）（pxK88acST1LTB）细胞裂解液；3为诱导3 h BL21（DE3）（pxK88acST1LTB）细胞裂解液；4为诱导4 h BL21（DE3）（pxK88acST1LTB）细胞裂解液；5为诱导5 h BL21（DE3）（pxK88acST1LTB）细胞裂解液；6、7为诱导6 h BL21（DE3）（pxK88acST1LTB）细胞裂解液；M为低分子蛋白Marker。2.4通气量对菌株生长的影响（见表4）由表4可知，采用改良LB培养基（10万mL）对BL21(DE3)(pXK88acST1LTB)菌株通气培养。其中以500 L/min的通气培养条件培养的菌数最高，3种通气量对目的蛋白的表达量无明显差异。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.002.T004表4通气量对菌株生长的影响Tab.4The effect of ventilation on the growth of strains通气量/(L/min)试验批次pH值活菌计数/(×109 CFU/mL)目的蛋白表达含量/%50017.0~7.88.629.231007.0~7.810.230.225007.0~7.811.730.1950027.0~7.88.428.751007.0~7.810.529.755007.0~7.812.430.2850037.0~7.88.128.471007.0~7.89.229.665007.0~7.811.529.832.5菌株灭活试验结果（见表5）选取3种不同浓度（0.4%、0.6%、0.8%）的甲醛溶液加入培养好的菌液中灭活。由表5可知，灭活培养菌数在1.15×1010~1.24×1010 CFU/mL之间的菌液以0.4%甲醛溶液（按菌液终浓度计算）灭活48 h，可以达到很好的灭活效果。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.06.002.T005表5菌株灭活试验结果Tab.5Strain inactivation test results组别活菌计数/(×1010 CFU/mL)平行甲醛溶液浓度/%灭活时间/h灭活检验011.171-10.412+1-20.424+1-30.448-1-40.612+1-50.624-1-60.648-1-70.812+1-80.824-1-90.848-021.242-10.412+2-20.424+2-30.448-2-40.612+2-50.624-2-60.648-2-70.812+2-80.824-2-90.848-031.153-10.412+3-20.424+3-30.448-3-40.612+3-50.624-3-60.648-3-70.812+3-80.824-3-90.848-注 ：“+”表示有细菌生长；“-”表示无细菌生长。3讨论本研究中，关于工业化生产中诱导剂的筛选试验是在培养基配制好的20万mL的发酵罐中进行的。该菌株37 ℃培养4~6 h后，发酵罐内加入葡萄糖溶液（终浓度0.2%）用以补充碳源，继续培养菌株4 h。选取等量的菌液分别添加4种不同浓度的诱导剂（1.0 mmol/LIPTG、1.0 mmol/L乳糖、10.0 mmol/L乳糖和100.0 mmol/L乳糖）对菌株展开诱导，使目的蛋白大量表达。在诱导4 h后每种浓度各提取1 mL菌液，在低温（4 ℃）条件下，5 000 r/min离心5 min，使用100 μL 10 mmol/L Tris·Cl（pH值8.0）重悬菌体沉淀。依据所收集的试验材料使用常规的操作方法进行SDS-PAGE试验分析，得到的目的蛋白表达含量依次为33.21%、8.27%、26.39%、29.44%。根据研究资料，生产与检验所培养的菌种使用的培养容器等条件不同，于37 ℃温度下进行摇床，振荡培养2 h后，使用IPTG（终浓度为1.0 mmol/L）诱导4 h后，可收获所需的菌液，吸取1 mL菌液，4 ℃、5 000 r/min离心5 min，使用100 μL 10 mmol/L Tris·Cl（pH值8.0）重悬菌体使其沉淀，并按照常规的方法步骤进行SDS-PAGE试验分析。试验结果表明，所获得的目的蛋白表达量在40%左右。上述2次试验中，同是IPTG作为诱导剂的情况下蛋白的表达量却相差较大。原因可能是2次诱导蛋白的容器不同，培养的体系差别较大，补料条件不同，通气条件有差别，加入诱导剂时的菌液浓度有差别，因此导致2种情况下蛋白的表达量差别较大。根据试验数据分析，改良LB中的培养菌数比LB的高，比普通肉汤的低一点。改良LB批次之间差异小，能够保持疫苗的免疫原性和质量稳定的优点，且其生产成本比普通肉汤低50%以上。在工业化生产中选用改良LB培养基具有更大的经济效益。对于诱导剂来说，乳糖的加入浓度为100 mmol/L且诱导时间在6 h以上，目的蛋白的表达量较多。重组菌株中蛋白的表达，运用的是乳糖操纵子的原理（乳糖操纵子会转录表达β-半乳糖苷酶）。使用乳糖作为诱导剂，诱导的效果好且价格比IPTG低，更加适合于工业化的大量生产。在大肠杆菌培养时通入无菌空气维持罐内的氧溶解度，可促进其大量繁殖。本试验用10万mL发酵罐展开培养，在相同的培养条件下对3种不同通气量进行比较。在不影响蛋白相对表达量的情况下，培养菌数最高是500 L/min的通气量。由于本次试验所用菌株其质粒之中所含有的生物公害——卡那霉素抗性基因，所以在使用时必须灭活。试验数据分析表明，终浓度0.4%的甲醛溶液在37 ℃下，搅动、灭活48 h效果最佳。4结论本研究在成功地构建BL21(DE3)(pXK88acST1LTB)重组表达菌株基础上，从培养基的选取、通气量的多少、诱导剂的选择以及其对应的诱导条件（诱导时间及浓度）4个方面对其培养条件进行研究。结果表明，改良的LB培养基为培养该菌株的最适宜培养基，100 mmol/L乳糖诱导6 h，可实现经济效益最大化，同时确定在20万mL发酵罐中培养重组菌株的最适宜通气量为500 L/min。灭活试验结果表明，37℃ 0.4%甲醛灭活48 h，灭活效果彻底。本研究探索K88ac-ST1-LTB三价基因工程疫苗菌株最适的培养方法，确定最佳培养条件并进行灭活试验，从而为ETEC疫苗的成功研制和生产奠定基础。