草金鱼（Carassius auratus red var.）又名金鲫鱼。畜牧业和水产养殖业为了预防疾病和促进个体的快速生长，长期在饲料中添加抗生素[1-2]。大量使用抗生素影响鱼的生长和代谢，造成肠道菌群失调，影响观赏鱼体色，增加细菌的耐药性和污染水环境。酵母菌和芽孢杆菌是应用较为普遍的微生态制剂。酵母菌含有大量的蛋白质、维生素以及代谢酶在内的多种活性物质[3-4]，能够提供水产动物所需的多种必需氨基酸，酵母菌特有的脂肪酸等物质对鱼体的生长发育至关重要。酵母菌参与机体的抗菌、消炎、抗病毒等免疫机制[5]，用于发酵生产[6-7]。芽孢杆菌在生长代谢过程中会产生各种酶，能够促进体内复杂碳水化合物的消化[8]。在饲料中添加的酵母产品，具有和鱼粉相同的营养成分，使花鲈和杂交鲟等类鱼的生长代谢维持在正常水平，显著提高鱼体的血浆免疫和抗氧化功能等[9-12]。给草鱼投喂含有芽孢杆菌的饲料，能够促进机体的免疫水平和抗氧化能力，加快草鱼的生长[13-14]。沈斌乾等[15]采用添加芽孢杆菌的饲料喂养青鱼幼苗，发现青鱼饵料系数显著降低。采用添加胶红酵母和解淀粉芽孢杆菌的饵料投喂虹鳟，发现虹鳟的生长和肠道生态有明显改善[16]。本试验以草金鱼为研究对象，用酵母菌和芽孢杆菌发酵配合饲料，探究该饲料对草金鱼的消化、体色及肠道菌群等方面的影响，以期为观赏鱼的配合饲料加工、提高饲料利用率，减少排放提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验用鱼180尾规格一致、健康的草金鱼由天津市金水族水产养殖有限公司提供，初重为（22.13±1.43）g，初始体长为（8.42±0.41）cm。1.1.2试验日粮试验日粮购自天津市晨辉饲料有限公司。粗蛋白35.8%、粗脂肪9.6%、水分9.5%、灰分7.3%。1.2试验方法1.2.1发酵日粮准备10 g基础日粮于封口袋，按照不同水分和接菌比例组合，共计27组。发酵12 h，将发酵饲料用生理盐水稀释涂板，通过活菌计数，不同条件下发酵日粮中的活菌数见表1。在水分含量为40%、酵母菌接菌量为6%、芽孢杆菌接菌量为4%的条件下发酵日粮中活菌数含量最高。以此日粮作为试验组饲料，发酵温度为室温。对照组日粮为基础饲料。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.016.T001表1不同条件下发酵饲料中的活菌数水分/%a（2%）b（2%）a（2%）b（4%）a（2%）b（6%）a（4%）b（2%）a（4%）b（4%）a（4%）b（6%）a（6%）b（2%）a（6%）b（4%）a（6%）b（6%）4083×10767×10687×10723×10613×10786×10821×10768×10796×1065061×10742×10799×10742×10764×1073×10764×107456×10723×1076092×10627×10717×10723×10757×10778×10787×10798×10775×107注：a表示芽孢杆菌，b表示酵母菌。1.2.2试验设计及饲养管理草金鱼暂养2周后分组，180尾鱼随机分在试验组（T）和对照组（C）中，每组设3个重复，每个重复30尾鱼。严格按照四定投喂法。每周更换1次循环水桶中的水，换水量为1/3到1/2，养殖期间温度在26~28 ℃。1.2.3样品采集饲养30 d后，随机从试验组和对照组各取一半鱼，进行第1次取样，对照组和试验组分别用C1和T1表示。饲养60 d后，进行第2次取样，对照组和试验组分别用C2和T2表示。在冰浴条件下解剖草金鱼，收集皮肤、鳍条、鳞片、肌肉，前肠、中肠、后肠及肠道内容物等，-80 ℃冰箱保存备用。组织匀浆液的制备，将组织和0.85%生理盐水按照1∶9的比例稀释成10%的匀浆液，在4℃、4 000 r/min条件下离心10 min。取上清液，保存于-20℃，备用。1.3测定指标及方法草金鱼体色指标的测定：使用纱布将鱼体表面的水分吸干，用色彩色差仪测定草金鱼一侧胸鳍。记录鱼体的L*值（亮度）、a*值（+a*红，-a*绿）、b*值（+b*黄，-b*蓝）等数据。总类胡萝卜素含量的测定：参考赵文等[17]方法。取试验鱼的皮肤、鳞片和鳍条等组织，使用剪刀将其剪碎，在电子天平上准确称取0.1 g，用丙酮定容至5 mL，放入超声波清洗40 min，取出，4 ℃、4 000 r/min离心10 min，4 ℃静置24 h。肠道消化酶含量的测定：草金鱼肠道淀粉酶和脂肪酶指标的测定参考南京建成科技生物公司采购的试剂盒检测说明书测定。蛋白酶的测定采用白燕等[18]的方法。肠道菌群的测定：肠道内容物在液氮条件下送至上海美吉生物医药科技有限公司检测。1.4数据统计与分析数据采用Excel软件计算，采用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较分析，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1酵母菌和芽孢杆菌发酵饲料对草金鱼组织总类胡萝卜素含量和体色的影响（见表2）由表2可知，草金鱼体表色彩随养殖周期的延长而增强。养殖60 d后，试验组草金鱼的亮度和红度显著高于对照组（P0.05）。在同一组内草金鱼总类胡萝卜素含量大小顺序为：鳍条皮肤鳞片。养殖30 d后，对照组鳞片、鳍条和皮肤中总类胡萝卜素含量显著高于试验组（P0.05）。在养殖60 d后，试验组鳍条中总类胡萝卜素含量显著高于对照组，是对照组的1.27倍（P0.05），其他组织无明显变化（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.016.T002表2酵母菌和芽孢杆菌发酵饲料对草金鱼体色的影响组别鳞片/(mg/kg)鳍条/(mg/kg)皮肤/(mg/kg)亮度红度黄度C1175.80±18.31b366.00±74.21b262.13±18.42b60.21±0.02a50.21±1.02a61.35±0.14aT185.67±11.72a226.67±33.63a135.53±12.32a63.52±0.03a52.85±0.04a62.62±0.63abC2168.32±21.62a202.27±33.52a164.42±2.13a64.27±2.04a53.37±0.16a64.73±2.51aT2138.42±23.54a256.19±45.85b183.74±17.12a68.83±0.42b55.21±1.32b66.26±3.71a注：同列数据肩标字母不同表示差异显著（P0.05），字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2酵母菌和芽孢杆菌发酵饲料对草金鱼肠道消化酶活力的影响2.2.1酵母菌和芽孢杆菌发酵饲料对草金鱼肠道蛋白酶活性的影响（见表3）由表3可知，草金鱼体内肠道蛋白酶活性大小顺序为：后肠中肠前肠。养殖30 d后，试验组的前、中、后肠的蛋白酶活性明显高于对照组，分别是对照组的1.03、1.07、1.07倍（P0.05）；在养殖60 d后，试验组中肠蛋白酶活性是对照组的1.06倍（P0.05），其他组织无明显变化（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.016.T003表3酵母菌和芽孢杆菌发酵饲料对草金鱼肠道蛋白酶活性的影响组别前肠中肠后肠C1219.12±12.23a232.47±1.23a265.75±13.65bT1225.74±22.31b248.66±3.21b284.74±0.37aC2224.56±12.32c237.91±0.86a270.48±2.37bT2234.46±25.76c252.02±1.79b286.02±3.68bU/g prot2.2.2酵母菌和芽孢杆菌发酵饲料对草金鱼肠道淀粉酶活性的影响（见表4）由表4可知，在养殖30 d后，试验组中肠的淀粉酶活性显著高于对照组（P0.05）；在养殖60 d后，试验组中肠和后肠肠道淀粉酶活性显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.016.T004表4酵母菌和芽孢杆菌发酵饲料对草金鱼肠道淀粉酶活性的影响组别前肠中肠后肠C10.56±0.04a0.41±0.01a0.54±0.01aT10.41±0.14a0.69±0.06c0.53±0.03aC20.95±0.01b0.53±0.01b0.52±0.04aT20.63±0.31a0.78±0.02c0.84±0.04bU/g prot2.3酵母菌和芽孢杆菌发酵饲料对草金鱼体肠道菌群指标的影响2.3.1样本信息测序结果（见表5）由表5可知，A组和C组平均序列数分别为55 149个和56 284个，平均碱基数分别为23 756 156个和24 336 378个。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.016.T005表5草金鱼肠道菌群多样性测序结果样本序列数碱基数平均长度/bp最短长度/bp最长长度/bpA157 09524 650 569431.746 545 2366453A253 20322 861 743429.707 798 4391453C157 15824 677 066431.734 245 4388452C255 41023 995 690433.057 029 44014532.3.2OUT聚类分析测序结果在I-Sanger云平台上通过物种组成分析中的Venn图分析，可用于统计多个样本中共有和特有的OTU数目，可以直观表现出环境样本在不同的分类水平上的组成相似性和重叠性。草金鱼肠道菌群OUT聚类分析见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.016.F001图1草金鱼肠道菌群OUT聚类分析由图1可知，对照A组和试验C组共有的OTU 364个，A组特有OTU 67个，C组特有OTU 196个。从肠道菌群多样性进行分析比较，C组的肠道菌群生物多样性高于A组。2.3.3草金鱼肠道微生物多样性指数分析（见表6）由表6可知，对照A组和试验C组的覆盖率均大于98%，测序结果可代表草金鱼肠道菌群。C组和A组相比，Sobs指数提高48%；Shannon指数提高9%，Ace指数提高37%；Chao指数提高31%；而Simpson指数降低75%，说明试验C组肠道菌群多样性丰富。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.016.T006表6草金鱼肠道菌群多样性指数分析组别Sobs指数Shannon指数Simpson指数Ace指数Chao指数Coverage指数A组310.3332.8900.216362.274377.0080.999C组458.3334.0070.055496.287493.5220.9992.3.4酵母菌和芽孢杆菌发酵饲料对草金鱼肠道菌群的组成草金鱼肠道菌群丰度见图2。从酵母菌和芽孢杆菌发酵饲料对草金鱼在门、纲、目、属水平上肠道菌群的组成分析表明，对照组A和试验组C草金鱼肠道微生物种类组成上差异不显著（P0.05）。图2草金鱼肠道菌群丰度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.016.F2a1（a）在门分类水平上的菌群丰度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.016.F2a2（b）在纲分类水平上的菌群丰度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.016.F2a3（c）在目分类水平上的菌群丰度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.016.F2a4（d）在属分类水平上的菌群丰度由图2（a）和图2（b）可知，在门和纲水平上，对照组A和试验组C肠道中丰度最高的均为放线菌纲（Actinobacteria）、变形杆菌纲（Alphaproteobacteria）、梭杆菌纲（Fusobacteriales）、浮霉菌纲（Planctomycetacia）。试验组C组中，放线菌、变形杆菌纲的含量显著高于对照组，梭杆菌纲的含量显著低于对照组。由图2（c）和图2（d）可知，在目和属水平上，对照组A和试验组C肠道中丰度最高的菌种种类一致，分别为棒状杆菌目（Corynebacteriales）、根瘤菌目（Rhizobiales）、浮霉菌目（Planctomycetacia）、梭杆菌目（Fusobacteriales）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、单鳞属（Singulisphaera）、鲸蜡菌属（Cetobacterium）和其他菌属。试验组C中的棒状杆菌目、根瘤菌目、分枝杆菌属、其他菌属的含量显著高于对照组A，而梭杆菌目的含量显著降低。3讨论3.1酵母菌和芽孢杆菌发酵饲料对草金鱼体色的影响观赏鱼的体色是其经济价值的主要依据[19]。由于类胡萝卜素的沉积，鱼类会在皮肤、鳍条、鳞片等部位而表现出颜色。鱼类自身无法合成类胡萝卜素，必须通过摄食从饵料中获取。本试验结果表明，养殖60 d后，试验组草金鱼的亮度和红度显著提高，试验组鳍条中总类胡萝卜素含量明显高于对照组，是对照组的1.27倍与公翠萍等[20]结论一致。研究表明，酵母菌和芽孢杆菌对草金鱼鳍条部位的沉积明显，与姜志强等[22]的研究吻合。研究发现，使用万寿菊粉和小球藻混合发酵的饲料投喂锦鲤，可以对锦鲤增色[21]。公翠萍等[20]发现，在红罗非鱼体内的类胡萝卜素沉积在鳍中最高，其次为鳃，皮肤和肌肉最低。姜志强等[22]发现，锦鲤体内的皮肤和鳍是类胡萝卜素的主要沉积部位。非洲大峡谷中的唇斑丽雄鱼体色会随水深和透明度的变化而表现出不同的颜色[23]。马本贺等[24]在循环水养殖模式下探究不同光照条件对白条双锯鱼的体色影响，发现红光组中皮肤的胡萝卜素含量显著高于其他光照组。有研究表明，鲑鳟鱼类在鱼苗阶段类胡萝卜素主要沉积于皮肤部位，在后期稚鱼期阶段主要沉积在肌肉部位，等到性成熟期主要沉积在皮肤和卵巢部位[25]。3.2酵母菌和芽孢杆菌发酵饲料对草金鱼消化的影响鱼类的消化酶一般包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶[26]。鱼类对营养物质的吸收效率受消化酶活性的影响，进而影响鱼类的生长速度[27]。本试验发现，养殖30 d后，草金鱼试验组中肠的蛋白酶和淀粉酶活性显著提高；养殖60 d后，草金鱼试验组中肠的蛋白酶和淀粉酶活性显著提高。芽孢杆菌在代谢过程中会分泌产生蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等，能够有效降解机体内复杂的碳水化合物[8]，促进消化吸收。赵倩等[28]发现，使用添加芽孢杆菌的饵料饲养鲤鱼，60 d后，肠道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶均显著提高。说明用含酵母菌和芽孢杆菌的饵料对草金鱼的消化酶活性有所提高。3.3酵母菌和芽孢杆菌发酵饲料对草金鱼肠道菌群的影响鱼类肠道菌群主要参与营养物质吸收和维持机体的健康状况。在鱼类漫长的进化过程中，肠道内的一些微生物竞争为优势菌群，其代谢产生的维生素、酶等物质保证鱼类正常的生长。本试验发现，试验组肠道菌群生物多样性高于对照组，且肠道菌群多样性丰富。肠道菌群在门、纲水平上，试验组放线菌、变形菌的含量明显高于对照组；在目水平上，试验组棒状杆菌、根瘤菌的含量明显高于对照组；在属水平上，试验组分枝杆菌的含量明显高于对照组。有研究表明，酵母菌能改善鱼肠道菌群的平衡[9]，饲料中添加胶红酵母和解淀粉芽孢杆菌能够有效促进虹鳟肠道的优势菌群[16]。陆生动物的肠道菌群大多数是革兰氏阳性菌，而在鱼类的肠道菌群中革兰氏阴性菌占优势。Bagheri等[29]发现，使用添加芽孢杆菌的饵料喂养虹鳟幼鱼，在幼鱼的肠道菌群中发现微生物数量明显增加。有研究表明，使用富含益生菌的饲料投喂草鱼等水生动物，能够显著提升肠道中杆菌的数量[30]。本试验结果表明，使用酵母菌和芽孢杆菌发酵饲料能够显著增加肠道菌群的多样性，且试验组有益菌较对照组有所提高。4结论投喂酵母菌和芽孢杆菌发酵饲料可以改善草金鱼体表的亮度和红度，且鳍条中类胡萝卜素含量显著提高。投喂酵母菌和芽孢杆菌发酵饲料，草金鱼中肠蛋白酶和淀粉酶活力明显增加，且30 d投喂效果好于60 d。投喂酵母菌和芽孢杆菌发酵饲料，草金鱼肠道菌群的多样性显著增加，且有益菌增加。