2018年，中国全年大豆进口量为8 803.1万t。进口的大豆主要作为蛋白添加剂[1]。饲料蛋白的来源主要有植物蛋白、动物蛋白和单细胞蛋白。与微生物相比，植物或动物具有较长的生长周期，作为蛋白饲料添加剂会增加蛋白的生产成本。相较植物蛋白和动物蛋白，单细胞蛋白具有较高的蛋白转化效率和更加丰富多样的氨基酸种类，不仅能够满足动物生长代谢的必需营养要求，还能提高饲料的利用率[2]。而且单细胞蛋白的应用符合现代社会绿色环保的生产理念。甲酸是一碳化合物代谢途径上的主要分支点[3]，是许多一碳化合物利用型菌株的中间代谢产物。甲酸合成方法主要包括二氧化碳的电化学还原和氢化过程[4-6]等。研究以甲酸为唯一碳源筛选高产蛋白的微生物菌株，采用单因素法对高效菌株的生理特性进行分析，并对其发酵工艺进行研究，以期在利用甲酸生产高附加值且绿色的单细胞蛋白生产领域提供参考。1材料与方法1.1样品及试剂试验所需样品由海南东寨港红树林自然保护区和中国科学院天津工业生物技术研究所提供。甲酸为色谱纯外，其余药品纯度均为分析纯。1.2培养基筛选培养基：甲酸钠5 g/L、氯化钠0.5 g/L、六水氯化镁0.5 g/L、二水氯化钙0.1 g/L、氯化钾0.5 g/L、磷酸二氢钾0.2 g/L、氯化铵0.2 g/L。种子培养基（LB培养基）：酵母粉5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、氯化钠10 g/L。发酵培养基：甲酸钠5 g/L、氯化钠0.5 g/L、六水氯化镁0.5 g/L、二水氯化钙0.1 g/L、氯化钾0.5 g/L、磷酸二氢钾0.2 g/L、氯化铵2 g/L。以上3种培养基，固体培养基分别加入1.5%琼脂粉，调pH值6.5~7.5，121 ℃，1×105 Pa蒸汽灭菌20 min备用。1.3试验方法1.3.1耐甲酸高效菌株的筛选称取1 g土样、2片叶子和1 mL海水加入甲酸筛选培养基中，37 ℃、180 r/min摇瓶培养48 h，取50 μL菌液均匀涂布在固体筛选培养基中，37 ℃培养至长出单菌落。将初筛得到的菌株在甲酸筛选固体培养基中连续转接3次，将纯化后单菌落接种到液体甲酸筛选培养基中，37℃，180 r/min摇瓶培养48 h。将生长良好的菌液按1%的接种量转接至新鲜筛选培养基中，培养48 h测定菌株的甲酸消耗速率，菌体OD值和蛋白含量。选取甲酸消耗率高、生长速度快且蛋白含量高的菌株进行下一步研究。1.3.2高效菌株的分子鉴定菌株的鉴定采用16S rDNA序列分析法，其中采用菌落PCR方法扩增菌株的16S rDNA，具体操作方法如下：挑取单菌落于10 μL无菌水中，与1 μL上游引物，1 μL下游引物，12.5 μL 2× taq master mix（Generay）混合，制备成25 μL的PCR体系。PCR程序：95 ℃预变性10 min；35个循环，每个循环参数为：95 ℃变性30 s、54 ℃复性30 s、72 ℃延伸90 s、最后72 ℃延伸5 min。引物为16S rDNA通用引物，引物序列为27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR扩增产物交由华大基因测序。测序结果与Genebank数据库中公开的16S rDNA序列进行同源性比对，选取同源性高且已发表的菌株序列，采用MEGA-X软件以邻接法构建系统发育树。通过分析选取适合作为饲料添加剂的菌株进行下一步深入研究。1.3.3菌株的生理特性分析1.3.3.1菌株的生长条件优化采用单因素法对初始pH值和温度两个培养条件对菌株生长的影响进行分析。初始的pH值设为6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，按照1%接种量将种子培养基培养的菌液接入发酵培养基中，在37 ℃，180 r/min摇床培养24 h，取样进行生物量分析；温度设为26、30、35、37、40 ℃，按1%接种量将种子培养基培养的菌液接种于pH值为7的发酵培养基中，180 r/min摇床培养24 h，取样进行生物量分析。1.3.3.2培养基优化采用单因素法对碳源浓度、氮源种类和碳氮比3个因素对菌株生长和蛋白质含量的影响进行分析。以甲酸钠为碳源，设置2、5、8、11、14 g/L 5个梯度，按1%接种量接种pH值7的发酵培养基中，37 ℃、180 r/min摇床培养24 h，取样进行生物量分析；分别使用2 g/L的氯化铵、硝酸钠、硫酸铵、尿素、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉作为氮源，按1%接种量接种pH值为7，甲酸钠浓度为5 g/L的发酵培养基中，180 r/min摇床培养24 h，取样进行生物量和蛋白含量分析；在碳源甲酸钠浓度为5 g/L，以酵母粉为氮源设置碳氮比（摩尔比）梯度为10.53、7.86、7.20、6.98、6.79，按1%接种量接种于pH值7发酵培养基，37 ℃、180 r/min摇床培养24 h，取样进行生物量和蛋白含量分析。1.3.4高效菌株的发酵工艺采用3 L发酵系统对高效菌株的发酵工艺进行研究。按1%接种量将种子液接种于发酵培养基中，接种前通过手动控制发酵平台的甲酸流加系统，使培养基中甲酸含量稳定在5 g/L左右，手动控制发酵平台的氨水流加系统，控制培养基内pH值稳定在7。温度保持在37 ℃，起始转速设为200 r/min。发酵开始后，设置甲酸流加系统为自动，发酵平台将根据培养基内pH值的变化自动调节甲酸的添加量。为了监测菌体在发酵过程中的生长状况、蛋白合成和甲酸利用情况，在发酵前期36 h，取样间隔为12 h，之后取样间隔为24 h，定期测定发酵参数。发酵过程中，随着菌体浓度的逐渐增大，培养基内的溶氧量开始逐渐降低，发酵42 h后，培养基内溶氧量低至0.2%，增加转速至300 r/min。发酵过程中，随着菌体浓度的增加，氮源含量也会逐渐降低，需要根据监测到的菌浓变化及时补充氨水，增加培养基内的氮源含量。1.3.5分析检测方法1.3.5.1甲酸含量测定利用高效液相色谱法测定溶液中甲酸的含量[7-9]。色谱条件：高效液相色谱仪（SHIMADZU，RID-10A）；流动相为5 mmoL/L硫酸水溶液，流速0.5 mL/min；柱温55 ℃；进样量10 μL；柱子选择Aminex HPX-87H色谱柱。样品预处理：使用10 mmoL/L硫酸稀释样品中甲酸浓度至标曲范围内，控制样品pH值1~2。甲酸标准曲线制作：标准品选用色谱纯级甲酸（Solarbio），设计5个或5个以上浓度梯度的甲酸标准品，以甲酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线并得到回归方程。本研究涉及的甲酸标准曲线回归系数r都在0.99以上，说明甲酸在标品浓度梯度范围内线性关系良好。标准品浓度梯度设计时要满足待测样品中的甲酸浓度处于标品浓度梯度范围内，标准品利用流动相5 mmoL/L的硫酸稀释。1.3.5.2生物量测定生理特性分析部分生物量测定采用分光光度法，取200 μL菌液，使用蒸馏水将菌液浓度稀释至OD600 nm≤0.8，利用酶标仪（BioTek，Neo2）测定菌液在波长为600 nm处的吸光值。发酵工艺研究部分生物量测定采用干重法，取适量菌液，8 000 r/min条件下离心10 min，收集菌体，菌体分别使用生理盐水洗涤3次，蒸馏水洗涤1次，冷冻干燥24 h，称量菌粉重量并记录数据[10]。1.3.5.3蛋白质含量测定蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法，在薛爱群等[11]研究基础上进行修改。菌体利用生理盐水洗涤3次，蒸馏水洗涤1次，向菌体沉淀中加入10 mL蒸馏水重悬，进行超声破碎，超声功率270 W、超声3 s、停7 s、超声10 min；直到菌液澄清透明为止，取1 mL样品与5 mL 0.1 moL/L的氢氧化钠水溶液混匀，沸水浴10 min后得到反应液。将反应液定容至10 mL，通过考马斯亮蓝法测定蛋白含量。需要注意控制颜色反应时长，反应时长从加样完成并混匀后计算，严格控制反应3 min，在595 nm处得到的吸光值，将该吸光值代入牛血清蛋白标准曲线公式中获得蛋白含量[12]。考马斯亮蓝法测定蛋白含量方法中标准曲线的制作方案见表1。待测样品按照表1中6号管方式加样。以蛋白质含量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线并得到回归方程，本研究涉及的牛血清蛋白标准曲线回归系数r都在0.99以上，说明蛋白质在0~100 μg含量范围内线性关系良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.021.T001表1考马斯亮蓝法测定蛋白含量方法中标准曲线的制作方案管号1234561 000 mg/L标准蛋白溶液/mL0.000.020.040.060.080.10蒸馏水/mL1.000.980.960.940.920.90考马斯亮蓝试剂/mL5.005.005.005.005.005.00蛋白质含量/μg0.0020.0040.0060.0080.00100.001.3.5.4氮含量测定总氮测定采用分光光度法[13]，总碳测定采用干法氧化方法[14]。1.4数据统计与分析试验设计3个重复，数据以3个重复的“平均值±标准差”表示。2结果与分析2.1菌株筛选从不同样品中通过富集、平板分区划线和转接培养方法，筛选出6株在甲酸钠培养基中生长良好的菌株，分别命名为MA1、MA2、MA3、MA4、MA5、MA6。菌株MA1~6的生长情况、甲酸消耗速率、蛋白含量见图1。图1菌株MA1-6的生长情况、甲酸消耗速率、蛋白含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.021.F1a1（a）菌株MA1-6的生长情况10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.021.F1a2（b）菌株MA1-6的甲酸消耗速率10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.021.F1a3（c）菌株MA1-6的蛋白含量由图1可知，MA3和MA5相对其他菌株，生长速率、蛋白含量和甲酸消耗速率的综合能力较强。相同条件下培养48 h后，菌株MA3的OD值、蛋白含量和甲酸消耗速率分别为0.262、54.58%和0.067 g/(L·h)，菌株MA5的OD值、蛋白含量和甲酸消耗速率分别为0.237、43.68%和0.098 g/(L·h)。甲酸标准曲线为y=19 319x，r=0.997 0（使用范围2.5~10.0 g/L）；牛血清蛋白标准曲线为y=0.002 7x+0.011 8 r=0.996 1（使用范围0~100 μg）。2.2菌株的分子鉴定采用16S rDNA序列分析法对分离获得的6株甲酸利用菌（MA1~6）进行分子鉴定。MA1-MA6的菌种鉴定结果见表2。菌株MA5 16S rDNA系统进化树见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.021.T002表2MA1-MA6的菌种鉴定结果菌株名称序列长度/bp与其同源性高的菌株名称（NCBI登录号）相似度/%MA11 351Paracoccus versutus strain ATCC 25364（NR042713.1）99.70MA21 370Paracoccus sp. R-25059（AM084106.1）99.85MA31 216Paracoccus pantotrophus（AB098590.1）100.00MA41 364Tistrella mobilis strain 2PR56-11（EU440998.1）99.78MA51 261Paracoccus communis strain G9-1（MG557686.1）100.00MA61 292Ochrobactrum anthropi strain DP5（MT534544.1）100.0010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.021.F002图2菌株MA5 16S rDNA系统进化树由表2可知，6株菌株中4株属于副球菌属，1株属于Tistrella，1株属于Ochrobactrum，与NCBI中同源性高的菌株的相似度达到99%~100%。其中，MA5菌株与Paracoccus communis strain G9-1同源性最高，且采用邻接法构建系统进化树中其与Paracoccus communis strain G9-1归为一类，故菌株MA5鉴定为Paracoccus communis。综合考虑菌株的性能，选定菌株MA5进行深入研究。2.3菌株MA5的生理性能分析菌株MA5经革兰氏染色呈紫色，为革兰氏阴性菌，100×10×显微观察，菌体呈短杆状，多数情况下成对出现。该菌为兼性厌氧菌，在甲酸培养基上有氧培养24 h后，菌落形态呈淡黄色，表面光滑湿润，周围呈辐射状，在含有甲酸的液体培养基中培养液呈现淡黄色。2.3.1初始pH值对菌株MA5生长的影响（见图3）由图3可知，菌株MA5在pH值6.5~7.0之间，菌体生长速度差别不大。当pH值增加到7时，菌体浓度达到最大值。随着pH值的升高，菌体浓度开始下降。因此，pH值7是菌体最适生长pH值。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.021.F003图3初始pH值对菌株MA5生长的影响2.3.2培养温度对菌株MA5生长的影响（见图4）由图4可知，温度在26~37 ℃时，菌体浓度随着温度的升高而增加。菌体在37 ℃浓度达到最大值。温度继续升高，菌体浓度开始下降。因此，37 ℃为菌株MA5的最适生长温度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.021.F004图4培养温度对菌株MA5生长的影响2.3.3不同甲酸钠浓度对菌株MA5生长的影响（见图5）由图5可知，甲酸钠浓度小于5 g/L时，菌体浓度随着甲酸钠浓度的增加而增加，呈正相关关系。随着甲酸钠浓度的增加，菌体浓度开始下降。因此，5 g/L是菌株MA5的最优甲酸钠浓度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.021.F005图5不同甲酸钠浓度对菌株MA5生长的影响2.3.4不同种类氮源对菌株MA5生长、蛋白产量及蛋白含量的影响（见图6）由图6可知，有机氮源相较无机氮源更佳。有机氮源中酵母粉作为氮源时菌体生长速率最快。培养24 h后，菌液OD600 nm值为2.75，蛋白质产量最高为0.54 g/L；无机氮源中硝酸钠作为氮源时菌株MA5的生长最快，培养24 h后，菌液OD600 nm值为0.84，蛋白质产量为0.02 g/L；硫酸铵作为氮源时，MA5生长速率仅次于硝酸钠，培养24 h后菌液OD600 nm值为0.54，蛋白产量为0.06 g/L。硝酸钠、硫酸铵和酵母粉3种氮源对菌株MA5的蛋白质含量进行比较，结果显示，硝酸钠为氮源时菌株的蛋白含量最低，硫酸铵和酵母粉为氮源时菌体内的蛋白含量分别为56.90%和59.64%，两者相差不大。综合比较，有机氮源酵母粉为最佳氮源。牛血清蛋白标准曲线为y=0.003 9x+0.004 3，r=0.999 0（使用范围0~100 μg）。图6不同种类氮源对菌株MA5生长、蛋白产量及蛋白含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.021.F6a1（a）不同种类氮源对菌株MA5生长的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.021.F6a2（b）不同种类氮源对菌株MA5蛋白产量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.021.F6a3（c）不同种类氮源对菌株MA5蛋白含量的影响2.3.5不同碳氮比，对菌株MA5生长、蛋白产量及蛋白含量的影响（见图7）试验所用酵母粉（Solarbio）中总碳含量为63.60%，总氮含量为12%，据此计算培养基内的碳氮比。由图7可知，随着碳氮比的升高，菌株MA5的生物量和蛋白质产量降低。碳氮比为7.20∶1时，菌体OD600 nm值为0.94，蛋白产量为1.31 g/L，蛋白含量最高为59.91%。因此，7.20∶1是菌株MA5的最佳碳氮比。牛血清蛋白标准曲线为y=0.003 9x+0.004 3，r=0.999 0（使用范围0~100 μg）。图7不同碳氮比对MA5生长、蛋白产量及蛋白含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.021.F7a1（a）不同碳氮比对MA5生长的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.021.F7a2（b）不同碳氮比对MA5蛋白产量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.021.F7a3（c）不同碳氮比对MA5蛋白含量的影响2.4发酵过程中菌株MA5的生物量、甲酸消耗速率及蛋白含量的变化情况（见图8）以酵母粉和氨水作为混合氮源，起始培养基内含有20 g甲酸，22 g氨水，pH值稳定在7。整个发酵过程历时169 h，总共消耗366.96 g甲酸，52.50 g氨水，最终得到4.67 g/L的生物量，1.75 g/L的蛋白产量。由图8可知，在发酵过程中生物量积聚与甲酸消耗速率的变化趋势基本一致。在发酵60 h之前，菌体的生长速率较快和甲酸消耗速率整体呈现上升的趋势。60 h之后，菌体生长速率开始变慢甲酸消耗速率也开始下降。直到81 h，补料20 g氨水后，菌株生长速度和甲酸消耗速率都开始提高。菌体的甲酸消耗速率在108 h达到最高值，为0.77 g/(L·h)。随着发酵的进行，酵母粉逐渐被耗尽，到后期无机氨氮为主要氮源，此时菌体的蛋白含量由最初的58%下降到37%。甲酸标准曲线为y=37 194x，r=0.999 0（使用范围0.5~10 g/L）；牛血清蛋白标准曲线为y=0.004 3x+0.004 4，r=0.998 3（使用范围0~100 μg）。图8发酵过程中菌株MA5的生物量、甲酸消耗速率及蛋白含量的变化情况10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.021.F8a1（a）菌株MA5生物量的变化情况10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.021.F8a2（b）菌株MA5甲酸消耗速率的变化情况10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.021.F8a3（c）菌株MA5蛋白含量的变化情况3讨论本研究从红树林底泥等环境中筛选到高效利用甲酸的菌株6株，通过比较生长速率、蛋白含量及甲酸消耗速率等指标，发现MA3和MA5的综合性能较好。通过16S rDNA序列分析，发现菌株MA3和菌株MA5分别与Paracoccus pantotrophus和Paracoccus communis菌株相似度为100%。两者皆属于副球菌属，菌株MA5的同源性菌株Paracoccus communis G9-1是普洱茶发酵中的重要菌株之一。考虑到作为饲料蛋白添加剂的安全性，所以将菌株MA5作为候选菌株进行进一步的深入研究。通过菌株的生理性能分析，发现菌株MA5能够利用甲酸为单一碳源进行生长代谢，在其最适培养条件下，以有机氮为氮源时，菌体内的蛋白含量和生长速率要高于无机氮；在无机氮中铵根离子作为氮源培养时，菌株MA5的蛋白含量要高于硝酸根离子氮源。比较有机氮（酵母粉）、无机氮（硫酸铵和硝酸钠）3种氮源对菌株MA5的蛋白含量影响，发现酵母粉与硫酸铵分别作为氮源时，菌体内的蛋白含量相差不大，但远高于硝酸钠。原因可能是以硝酸钠为氮源时，菌体体内的氮代谢主要以反硝化作用为主，大量的硝酸钠转化成亚硝酸盐或氮气，致使菌体内蛋白含量低；而当以硫酸铵和酵母粉为氮源时，菌体体内的氮代谢主要以同化吸收为主，氮源主要转化成自身细胞成分，所以蛋白含量相对较高[15]。在研究不同碳氮比对蛋白含量的影响过程中，发现在10.53~6.79时，碳氮比越小菌体生长速率越快，蛋白产量也越高，但蛋白含量最高点出现在碳氮比7.20时，说明不同碳氮比条件下菌株MA5的代谢途径发生变化，其代谢机理有待进一步研究。在3 L发酵体系中，在自动补料甲酸和手动补料氨水的模式下，菌体生物量总体呈现不断上升的趋势，甲酸利用速率出现2个波峰。造成波动的主要原因是氮源饥饿，当补足氮源后，菌体生物量的增加速率和甲酸利用速率都开始提高。但是，菌体内的蛋白含量总体呈现下降趋势，菌体在不同生长阶段时的蛋白含量也存在差异[16]，可能是造成蛋白含量下降的原因。该菌株在同时含有酵母粉和氨水2种氮源、混合发酵条件下，甲酸消耗速率和蛋白含量与之前文献中报道的数据[17-18]相比有明显的优势。4结论本研究从红树林底泥等环境中筛选到高效利用甲酸的菌株6株，通过比较生长速率、蛋白含量及甲酸消耗速率、分子鉴定等，选取性能优良的Paracoccus communis MA5进行深入研究。菌株MA5具有生长速率快、甲酸消耗率高且蛋白质含量高的特性，是进行转化甲酸生产单细胞蛋白工艺研究的优选菌株。菌株MA5在单细胞蛋白生产产业化应用领域具有广阔的研究前景。