初生细胞壁中纤维素、半纤维素和果胶分别占30%、30%和35%左右[1]。果胶被果胶酶分解后，植物细胞便分离。果胶酶是分解果胶的一类多酶复合体系，通过它们的联合作用可使植物纤维中的果胶质分解。果胶酶现已在医药、食品、环境、造纸、纺织、生物技术、饲料等领域均有广泛的应用[2-5]。果胶酶广泛应用于果汁提取、果酒发酵、果酒澄清与过滤、果实脱皮、饲料加工、茶叶发酵、工业废水处理等领域，可有效促进饮品澄清、提高果汁出汁率、酒的风味、天然药物活性成分提取率等[6-9]。果胶酶既可以提高产品质量，又可以减少生产对环境的污染[10-11]。前期试验以果胶为唯一碳源设计筛选培养基，从碱性缫丝废水中筛选出1株能利用缫丝废水发酵产碱性果胶酶的菌株G7，表型分析及ITS rDNA序列分子鉴定结果，发现该菌株为沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis）。利用紫外照射对G7进行诱变育种，获得1株酶活力有大幅度提高的正突变株G7-7。试验以沙福芽孢杆菌G7-7为研究菌种，开展果胶酶纯化及酶学性质研究。1材料与方法1.1试验材料菌种：沙福芽孢杆菌（B. safensis）G7-7，前期试验筛选诱变所得，由河池学院微生物及植物资源开发利用广西高校重点实验室保存。发酵原料：缫丝废水由广西嘉联丝绸厂提供。1.2仪器与设备NGC色谱系统（美国Bio-Rad公司）、infinite M200PRO全波长酶标仪（上海精密科学仪器有限公司）、ZWY-2102型立式全温度恒温摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）、PHS-3B型pH仪（上海精密科学仪器有限公司）、AvantiJE落地式离心机（美国贝克曼库尔特公司）。1.3培养基培养基制备参考文献[12]。种子培养液：蔗糖1 g、酵母粉0.5 g、氯化钠0.1 g溶于100 mL缫丝废水，pH值9.5。发酵培养液：蚕沙50 g、蔗糖11 g、磷酸氢二钾1 g、硫酸铁0.2 g，溶于1 000 mL缫丝废水，pH值9.5。酶活鉴定培养基：果胶0.50%、硫酸镁0.05%、硫酸铁0.01%、磷酸氢二钾0.02%、硝酸钠0.03%、琼脂2.00%。1.4试验方法1.4.1果胶酶酶活性测定DNS（3，5-二硝基水杨酸）法[13]参考文献适当改良。吸取0.2 mL适当稀释的酶液于具塞刻度试管中，加入1.8 mL浓度为0.4%的果胶底物溶液，50 ℃水浴反应30 min，加3 mL DNS（3，5-二硝基水杨酸）终止反应；沸水浴10 min，流水冷却，定容至15 mL，摇匀，540 nm波长测定吸光值。在上述反应条件下，每分钟催化果胶底物产生1.0 μmol半乳糖醛酸所需要的酶量定义为一个酶活力单位（U）。1.4.2果胶酶纯化所有纯化步骤均在4 ℃下进行，利用酶活鉴定培养基鉴定纯化酶。取粗酶液7份，每份100 mL，分别用30%~90%相对饱和度（10 %浓度梯度递增）的硫酸铵进行沉淀，放入冰柜，4 ℃静置12 h过夜。8 000 r/min、4 ℃离心20 min，收集沉淀。使用pH值4.8的柠檬酸缓冲溶液溶解沉淀，补足至原体积的1/5，Sephadex G-25凝胶柱快速脱盐，酶活鉴定培养基快速鉴定，平板鉴定是否具有果胶酶酶活，确定最佳硫酸铵纯化盐析区间。初步纯化酶产物4 ℃保存，进一步纯化。利用NGC色谱系统（Bio-Rad）进行纯化，Mono Q10/100GL（Amersham Biosciences，瑞典）强阴离子交换层析柱纯化：NGC色谱系统压力500 psi，以pH值8.3的0.01 mol/L Tris-HCl为起始缓冲液，添加1 mol/L的NaCl的pH值8.3的0.01 mol/L Tris-HCl为洗脱缓冲液，流速1 mL/min，设定60 mL体积缓冲液0~0.3 mol/L NaCl线性梯度洗脱分离蛋白质，每管收集0.5 mL，纯化酶4 ℃保存。测定果胶酶酶活性，SDS-PAGE检测蛋白纯度。1.4.3SDS-聚丙烯酰胺电泳依照Laemmli[14]的方法，以12%分离胶，4%浓缩胶，电泳缓冲液为pH值8.3 Tris-glycine buffer，考马斯亮蓝R250染色，纯化蛋白和低分子量标准蛋白相对迁移率以评估分子量。蛋白分子量标准购自宝生物工程（大连）有限公司（3597 A）。1.4.4温度和pH值相对酶活性的影响酶学性质试验相对酶活定义：以该试验项目某一个条件下的最高酶活为100%，其他条件下酶活性与最高酶活性的比值为相对酶活。在50 mmol/L甘氨酸-NaOH缓冲液（pH值9.5）中，30~90 ℃条件下测定酶活，确定果胶酶最适作用温度。将酶置于40~90 ℃恒温水浴保持60 min后，在60 ℃测定其残余酶活力，确定纯化果胶酶温度稳定范围。将酶保存于以下浓度均为50 mmol/L pH值3.0~11.0的缓冲液中：磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH值3.0~7.5；Tris-HCl缓冲液，pH值7.5~9.0；甘氨酸-NaOH缓冲液，pH值9.0~11.0。4 ℃放置24 h，30 ℃保持3 h，在最适温度下测定果胶酶相对酶活，确定最适反应pH值和pH稳定范围。做3次平行试验。1.4.5金属离子对酶活性的影响添加不同金属离子到纯化酶液中，使终浓度为2 mmol/L，测定酶活，研究不同金属离子对酶活性影响。做3次平行试验。1.4.6酶促反应动力学研究酶促反应动力学参数的测定[15]，以果胶为底物，pH值9.5甘氨酸-NaOH缓冲液，最适温度下，计算相应的初反应速度，利用Lineweaver-Burk plot求得纯化果胶酶的Km值和Vmax。2结果与分析2.1硫酸铵沉淀纯化硫酸铵饱和度在80%时，果胶酶酶活性出现最大值。取硫酸铵饱和度80%沉淀蛋白，pH值5.0乙酸钠缓冲溶液复溶，Sephadex G-25凝胶柱快速脱盐，初步纯化酶产物4 ℃保存，进一步纯化。2.2NGC色谱系统纯化NGC色谱系统采用强阴离子交换层析柱（Mono Q10/100GL），含有1 mol/L NaCl的Tris-HCl洗脱缓冲液，流速1 mol/L，梯度为0~0.5 mol/L的洗脱方法分离纯化果胶酶，发现分离纯化出的酶蛋白主要处于58号收集管内，沙福芽孢杆菌（B. safensis）G7-7果胶酶Mono Q10/100GL阴离子交换层析洗脱曲线见图1。沙福芽孢杆菌（B. safensis）G7-7果胶酶纯化过程见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.019.F001图1沙福芽孢杆菌（B. safensis）G7-7果胶酶Mono Q10/100GL阴离子交换层析洗脱曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.019.T001表1沙福芽孢杆菌（B. safensis）G7-7果胶酶纯化过程纯化步骤总酶活力/U总蛋白含量/mg比活力/(U/mg)纯化倍数酶活回收率/%初酶液21.838.00.321.0100.0(NH4)2SO4沉淀12.617.40.722.357.8Mono Q 10/100 GL6.65.61.183.730.3在8% NaCl浓度时洗出的第58蛋白峰包为果胶酶纯化酶。A为280 nm蛋白质紫外吸收值；B为洗脱缓冲液曲线，C为电导率曲线。横坐标为洗脱时间，纵坐标为280 nm蛋白质紫外吸收值（AU）。纯化果胶酶在酶活鉴定培养基平板上有白色透明圈，可以快速鉴定纯化酶。酶活鉴定培养基鉴定纯化果胶酶见图2。由表1可知，经过两步纯化法分离出沙福芽孢杆菌（B. safensis）G7-7的果胶酶，纯化回收率为29.4%，纯化倍数为3.7。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.019.F002图2酶活鉴定培养基鉴定纯化果胶酶将58号收集管内的酶液进行浓缩，SDS-PAGE电泳，纯化果胶酶聚丙烯酰胺凝胶电泳见图3。M为蛋白质分子质量标准，1为纯化酶，C为原始发酵液。由图3可知，SDS-PAGE显示，纯化的酶液跑电泳之后所显示出来的单一条带，蛋白分子量大约为57 kDa。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.019.F003图3纯化果胶酶聚丙烯酰胺凝胶电泳2.3纯化果胶酶酶学性质2.3.1最适温度及温度稳定性试验在25~90 ℃条件下将酶与果胶底物反应，通过测定酶活进而测得果胶酶的最佳反应温度。温度对果胶酶酶活的影响见图4。果胶酶的温度稳定性见图5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.019.F004图4温度对果胶酶酶活的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.019.F005图5果胶酶的温度稳定性由图4、图5可知，在25~35 ℃果胶酶酶活性处于上升状态，在35 ℃酶活性达最高。初步纯化的酶液分别在25 ℃、30 ℃下保温0.5 h和1 h相对酶活性均接近100%；在50 ℃下保温0.5 h和1 h相对酶活性分别为88.64%和86.04%，超过50 ℃酶活性逐渐降低，说明果胶酶在50 ℃之下酶活性比较稳定。2.3.2最适pH值及pH值稳定性试验（见图6、图7）由图6可知，在pH值3.0~9.0之间果胶酶酶活性逐渐上升，在pH值9.5时果胶酶的酶活性最高，表明该酶是碱性果胶酶。由图7可知，果胶酶相对酶活性在pH值7.0~11.0范围内稳定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.019.F006图6pH值对果胶酶的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.019.F007图7果胶酶的pH值稳定性2.4金属离子对纯化果胶酶的影响（见表2）由表2可知，试验所选择的金属离子都影响酶的活性，其中Cu2+、Ag+、Co2＋、Hg2+对沙福芽孢杆菌（B. safensis）G7-7纯化果胶酶有强烈的抑制作用，而K+、Mg2+、Mn2+、Ca2+对酶的激活作用明显，Na+、Zn2+无明显影响。加入适当的金属离子可以提高酶的催化效率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.019.T002表2金属离子对纯化果胶酶酶活影响金属离子（2 mmol/L）相对酶活/%初酶液100Na+102K+118Mg2+152Mn2+156Ca2+136Zn2+92Cu2+52Ag+38Co2＋36Hg2+262.5酶促反应动力学利用Lineweaver-Burk plot求得Km=8.75 g/L，Vmax=60.24 μg/(min·mL)。3结论前期利用缫丝废水及蚕沙开展产果胶酶菌种筛选及发酵产果胶酶条件优化研究[16]，缫丝废水原始pH值为9.5，筛选获得的产果胶酶菌种沙福芽孢杆菌（B. safensis）G7-7耐碱，为碱性酶。文章首次报道沙福芽孢杆菌G7-7产果胶酶纯化及酶学性质研究。通过硫酸铵盐析、Mono Q阴离子交换层析技术，分离纯化得到分子质量为57 kDa的果胶酶。发酵上清液经两步分离纯化后比活力达到6.6 U/mg，纯化回收率为30.3%，纯化倍数为3.7。最适pH值为9.5，酶在pH值7~11范围内稳定，为碱性果胶酶。50 ℃以下纯化酶稳定，最适温度36 ℃。纯化酶Km=8.75 g/L，Vmax=60.24 μg/(min·mL)。耐热性的酶作为催化剂具有明显的优势，高温经常更好地促进酶穿透细胞壁，水解效果更好，可以提高果胶水解糖化率。工业生产耐碱性、温度稳定性好、活力高的果胶酶，有利于提高果胶酶制剂的品质。