植物多糖具有免疫调节、抗菌、抗病毒、抗辐射、抗肿瘤、降血糖和降血脂等作用，但大枣多糖在饲料添加剂中的研究鲜有报道，大枣多糖具有免疫调节、抗氧化和抗衰老等作用[1-3]。本研究在肉鸡基础日粮中添加不同浓度的大枣多糖，探讨大枣多糖对鸡免疫功能和肉品质的影响，旨在为大枣多糖在肉鸡生产上的应用与推广提供参考。1材料与方法1.1试验动物1日龄爱维因肉鸡雏由锦州鸿强牧业有限公司提供。1.2试验日粮雏鸡饲料由大成农技（葫芦岛）有限公司生产，主要原料有玉米、豆粕、棉籽粕、鱼粉、碳酸氢钙、石粉、氯化钠、微量元素（硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸锰、硫酸锌和亚硒酸钠）、维生素（VA、VD3、VE、VK3、VB2和VB12）、氯化胆碱和功能性氨基酸（L-赖氨酸、DL-蛋氨酸、L-苏氨酸、L-苏氨酸和赖氨酸）。营养含量：粗蛋白20%、水分14%、粗灰分8%、粗纤维6%、赖氨酸1%、总磷0.55%、蛋氨酸0.42%~0.89%、氯化钠0.3%~0.8%和钙0.06%~1.20%。1.3药品及试剂大枣多糖购自晨光生物技术有限公司，纯度≥90%；盐酸左旋咪唑、鸡外周血淋巴细胞分离液试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；鸡白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）和干扰素-γ（IFN-γ）试剂盒购自上海岚派生物科技有限公司；异丙醇和冰乙醇购自山东旭晨化工科技有限公司；TaKaRa逆转录试剂盒和TB Green™ Premix Ex Taq™ II（Tli RNaseH Plus）试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；Trizol、Geletcin、marke、TAE（50x）和Invitrogen购自碧云天生物技术有限公司。1.4试验设计与饲养方法试验选用1日龄肉鸡雏300只，分成5组，每组3个重复，每个重复20只鸡。设KB组、YX组、1DT组、2DT组和4DT组。KB组肉鸡饲喂基础日粮，YX组在基础日粮中添加0.2 g/kg盐酸左旋咪唑，1DT组、2DT组和4DT组在基础日粮中分别添加1、2和4 g/kg大枣多糖。试验肉鸡网上饲养，自由饮水和采食，试验期42 d。1.5测定指标及方法1.5.1细胞因子含量参考马艳[4]、李晓丽[5]和毛亚芳等[6]试验方法，42日龄时，每组随机抽取3只鸡翅下静脉无菌采血2 mL，3 000 r/min离心10 min，制得血清。采用ELISA法测定血清中细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ含量，参考李贤等[7]试验方法进行检测，具体操作步骤按鸡ELISA检测试剂盒说明书进行。1.5.2IL-2、IL-4和IFN-γ mRNA表达量参考刘素贞等[8]试验方法，42日龄时，每组随机抽取3只鸡，翅下静脉无菌采取肝素抗凝血2 mL，加2 mL全血组织稀释液，移入含有3 mL淋巴细胞分离液的试管中。室温、750×g离心30 min。吸取白膜层至15 mL离心管中，加10 mL细胞洗涤液。室温、250×g离心10 min。弃上清，加5 mL细胞洗涤液再次重悬细胞。加4 mL完全培养基（胎牛血清∶RPMI-1640培养基=1∶9）。取90 µL加10 µL台盼蓝，注入玻片计数板上，利用倒置显微镜观察细胞活力至95%以上并用含10%血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为5×106个/mL。24孔细胞培养板中每孔加1 950 µL淋巴细胞悬液，每个样品重复两孔，在参数为37 ℃、CO2体积分数为5%及饱和湿度的CO2培养箱中培养12 h。1 500 r/min、4 ℃离心5 min，弃上清。加1 mL淋巴细胞洗涤液再洗涤2次。加1 mL trizol，12 000 r/min、4 ℃离心10 min，弃沉淀。加200 µL氯仿，剧烈摇晃30 s，冰浴10 min，12 000 r/min、4 ℃离心10 min。取上清500 µL，加500 µL异丙醇，轻柔颠倒8次，冰浴10 min，12 000 r/min、4 ℃离心10 min。弃上清。加1mL 75%冰乙醇，12 000 r/min、4 ℃离心10 min，弃上清，此操作进行2遍。冰浴风干30 min，加无RNA酶水（RNase-free水）20 μL溶解沉淀。取1 μL在超微量紫外可见分光光度计260 nm及280 nm波长处测定吸光度A的比值，记录Total RNA的浓度，若比值在1.8~2.1之间，表明提取的RNA纯度高，未被污染。按照TaKaRa逆转录试剂盒的说明书配制反应体系1见表1。反应条件：37 ℃，20 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.011.T001表1逆转录反应体系1组分体积/μLTotal10gDNA Eraser15X gDNA Eraser Buffer2RNA（1 μg/μL）1RNase Free dH2O6按照TaKaRa逆转录试剂盒的说明书配制反应体系2见表2。反应条件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s，得到cDNA样品-80 ℃保存[9]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.011.T002表2逆转录反应体系2组分体积/μLTotal20上述反应液105×PrimeScript Buffer2（for Real Time）4PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ1RT primer mix1RNase Free dH2O4试验引物核苷酸序列见表3，在Nucletide BLAST中进行序列比对，引物由TaKaRa公司合成。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.011.T003表3PCR引物设计引物引物序列（5'-3'）长度/bpIL-2 FTTCATCTCGAGCTCTACACACCAA181IL-2 RGCATTCACTTCCGGTGTGATTTAIL-4 FGCGTCAAGATGAACGTGACAGA147IL-4 RGGAGCTGACGCATGTTGAGGIFN-γ FAGCATTTGAACTGAGCCATCACC200IFN-γ RCCGTCAGCTACATCTGAATGACTTGβ-actin FATTGTCCACCGCAAATGCTTC113β-actin RAAATAAAGCCATGCCAATCTCGTC按照TB GreenTM Premix Ex TaqTM II （Tli RNaseH Plus）试剂盒的说明配制反应体系见表4。反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s（40个循环），60 ℃ 30 s（40个循环）[10]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.011.T004表4Real-time PCR反应体系组分体积/μLTotal25.0SYBR Premix EX Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（2X）12.5Primer F（10 μmol）1.0Primer R（10 μmol）1.0cDNA*2.0dH2O8.5以β-actin为内参基因，扩增完后在实时定量PCR仪上测定目的基因表达水平，使用2-ΔΔCt方法定量。数据取3次重复的平均值。从而得到目的基因IL-2、IL-4和IFN-γ的mRNA表达量。反应结束后进行电泳检测：第一道上7 μL marker，其余道上8 μL PCR产物，在电压110 V条件下进行电泳，35 min后，使用凝胶成像系统检测结果。1.5.3肉品质在42日龄测定失水率、剪切力、滴水损失、蒸煮损失、pH值和肉色亮度（L*）、红度（a*）和黄度（b*）[11-12]。1.6数据统计与分析数据使用统计软件SPSS 13.0进行一维方差分析，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1大枣多糖对肉鸡细胞因子含量及mRNA表达量的影响（见表5、图1~图3）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.011.F001图1IL-2 mRNA电泳图谱注：ACTB组：1.marker； 2.KB组；3.YX组；4. 1DT组；5. 2DT组；6. 4DT组。IL-2组：7.KB组；8.YX组；9.1 1DT组；10. 2DT组；11. 4DT组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.011.F002图2IL-4 mRNA电泳图谱注：ACTB组：1.marker； 2.KB组；3.YX组；4. 1DT组；5. 2DT组；6. 4DT组。IL-4组：7.KB组；8.YX组；9.1 1DT组；10. 2DT组；11. 4DT组。由表5、图1~图3可知，YX组、1DT组、2DT组和4DT组肉鸡的IL-2、IL-4和IFN-γ含量及mRNA表达量均极显著高于KB组（P0.01）；2DT组极显著高于1DT组和4DT组（P0.01）。研究表明，大枣多糖能够提高促进IL-2、IL-4和IFN-γ分泌及mRNA表达量，2DT组效果最佳。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.011.T005表5大枣多糖对肉鸡细胞因子含量及mRNA表达量的影响（n=3）项目KB组YX组1DT组2DT组4DT组细胞因子/（ng/L）IL-247.19±0.68Dd78.65±0.45Aa69.98±1.14Bb77.62±0.26Aa66.38±0.97CcIL-432.12±0.73Cc48.84±1.22Aa38.73±0.85Bb48.73±1.13Aa40.06±0.99BbIFN-γ11.34±1.74Cc26.99±0.52Aa16.87±0.39Bb25.59±1.523Aa18.09±2.44BbmRNAIL-2 mRNA1.00±0Cc7.23±0.54Aa4.64±1.24Bb7.00±0.60Aa4.57±0.57BbIL-4 mRNA1.00±0Cc8.59±0.11Aa5.57±0.65Bb8.32±0.82Aa6.45±0.04BbIFN-γ mRNA1.00±0Cc7.31±0.86Aa5.19±0.46Bb7.08±1.07Aa5.08±0.28Bb注：同行数据肩标小写字母不同表示差异显著（P0.05），大写字母不同表示差异极显著（P0.01），字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.011.F003图3IFN-γ mRNA电泳图谱注：ACTB组：1.marker； 2.KB组；3.YX组；4. 1DT组；5. 2DT组；6. 4DT组。IFN-γ组：7.KB组；8.YX组；9.1 1DT组；10. 2DT组；11. 4DT组。2.2大枣多糖对肉鸡肉品质的影响（见表6）由表6可知，1DT组、2DT组和4DT组胸肌和腿肌失水率极显著低于KB组和YX组（P0.01）。KB组、YX组、1DT组、2DT组和4DT组胸肌剪切力均差异不显著（P0.05）；1DT组和2DT组腿肌剪切力显著低于KB组、YX组和4DT组（P0.05）。1DT组和2DT组胸肌和腿肌滴水损失均显著低于KB组、YX组和4DT组（P0.05）。2DT组胸肌蒸煮损失显著低于KB组、YX组、1DT组和4DT组（P0.05）；KB组、YX组、1DT组、2DT组和4DT组腿肌蒸煮损失均差异不显著（P0.05）。1DT组和2DT组胸肌pH值均显著高于KB组、YX组和4DT组（P0.05）；KB组、YX组、1DT组、2DT组和4DT组腿肌pH值均差异不显著（P0.05）。KB组、YX组、1DT组、2DT组和4DT组胸肌和腿肌亮度（L*）和黄度（b*）均差异不显著（P0.05）。1DT组、2DT组和4DT组胸肌和腿肌红度（a*）极显著高于KB组（P0.01），显著高于YX组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.011.T006表6大枣多糖对肉鸡肉品质的影响（n=3）项目KB组YX组1DT组2DT组4DT组胸肌失水率/%11.21±0.58Aa10.53±0.57Aa7.20±0.83Bb6.38±0.76Bb7.30±0.14Bb剪切力/N3.62±0.08Aa3.60±0.08Aa3.59±0.03Aa3.59±0.07Aa3.61±0.08Aa滴水损失/%2.78±0.20Aa2.60±0.68Aa1.87±0.30Ab1.86±0.51Ab2.73±0.26Aa蒸煮损失/%32.52±1.86Aa29.67±2.04Aa29.20±1.06Aa27.86±0.12Ab30.08±1.65AapH值6.65±0.04Ab6.70±0.10Ab6.77±0.06Aa6.81±0.02Aa6.68±0.03Ab亮度（L*）/%29.85±1.72Aa29.85±1.47Aa32.68±0.35Aa34.08±1.16Aa30.33±0.60Aa红度（a*）/%2.33±0.10Bb2.38±0.31Bb7.48±0.39Aa8.03±1.87Aa6.80±0.86Aa黄度（b*）/%22.63±1.88Aa22.08±0.63Aa20.63±0.71Aa19.53±2.97Aa20.95±0.57Aa腿肌失水率/%8.67±1.07Aa8.14±0.57Aa5.48±0.35Bb5.30±0.36Bb6.22±0.96Bb剪切力/N3.72±0.07Aa3.61±0.02Aa3.60±0.04Ab3.56±0.10Ab3.68±0.05Aa滴水损失/%2.64±0.20Aa2.54±0.13Aa2.11±0.17Ab2.07±0.25Ab2.58±0.26Aa蒸煮损失/%32.15±2.23Aa29.26±1.67Aa28.98±1.03Aa28.88±0.75Aa29.57±2.01AapH值6.75±0.03Aa6.75±0.03Aa6.79±0.02Aa6.79±0.04Aa6.77±0.01Aa亮度（L*）/%32.08±2.56Aa32.10±2.29Aa32.83±0.63Aa35.05±0.69Aa32.30±0.53Aa红度（a*）/%7.00±1.44Ab7.00±0.57Ab12.00±0.12Aa10.83±1.15Aa8.88±2.19Aa黄度（b*）/%23.28±2.41Aa22.60±0.78Aa21.48±0.92Aa20.53±0.83Aa21.75±0.84Aa研究表明，大枣多糖能降低胸肌失水率、滴水损失和蒸煮损失，提高pH值和红度（a*）；能降低腿肌失水率、剪切力和滴水损失，提高红度（a*）。3讨论3.1大枣多糖对鸡免疫功能的影响淋巴细胞是机体的免疫活性细胞，只有在受抗原刺激后才能激活产生特异性免疫应答。淋巴细胞包括参与体液免疫的B细胞和参与细胞免疫的T细胞，细胞因子分泌是T细胞活化的重要标志。细胞因子主要参与细胞间信息的传递，细胞生长和分化，疾病的发生，影响机体的免疫调节作用。李凤娇等[3]研究体外分离小鼠脾淋巴细胞，设计空白组、阳性对照组（左旋咪唑）以及不同质量浓度的大枣多糖组（终浓度为20、40、80、160 和320 mg/L），MTT法观察大枣多糖对小鼠淋巴细胞增殖的影响情况；采用ELISA法观察大枣多糖对小鼠淋巴细胞上清液中 IL-2、IL-6、IL-10、IL-12水平的影响；QRT-PCR检测大枣多糖对小鼠淋巴细胞 IL-2、IL-6、IL-10、IL-12 mRNA表达的影响，结果显示，大枣多糖能够促进脾淋巴细胞增殖，促进淋巴细胞Th1型细胞因子IL-2和IL-12，Th2型细胞因子IL-6和IL-10分泌及其mRNA的表达。本研究中，鸡血清中IL-2、IL-4和IFN-γ分泌量和mRNA表达量YX组、1DT组、2DT组和4DT组均极显著高于KB组，表明大枣多糖能促进血清中IL-2、IL-4和IFN-γ的分泌及mRNA表达量，与上述结果相一致。大枣多糖可活化T细胞，提高血清中IL-2、IL-4和IFN-γ mRNA相对表达量，来影响IL-2、IL-4和IFN-γ分泌，从而发挥其免疫功能。3.2大枣多糖对鸡肉品质的影响刁蓝宇等[11]将乳酸、富马酸、高活性乳酸杆菌和恩拉霉素预混剂配制成酸化剂与益生菌混合制剂，利用84日龄广西三黄鸡，设对照组、不同浓度酸化剂与益生菌混合制剂组（在每千克基础日粮添加1 g和2 g酸化剂与益生菌混合制剂），饲喂6 d，饲养至118日龄屠宰，添加2 g酸化剂与益生菌混合制剂能够显著降低胸肌和腿肌的滴水损失。郑光耀等[12]将杨树皮提取物、木醋液和沸石粉配制成杨树皮提取物复方制剂，利用1日龄罗斯308肉鸡，设空白对照组，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组（在基础日粮中添加 0.35%、1.75%和3.50%的杨树皮提取物复方制剂），饲养42 d，试验Ⅱ组和Ⅲ组的滴水损失率和蒸煮损失率均显著低于空白对照组。李可等[13]研究利用１日龄的爱拔益加肉仔鸡，设对照组，试验1组、2组和3组分别在日粮中添加地衣芽孢杆菌（≥3×106 CFU/g）、屎肠球菌（≥1×106 CFU/g）和丁酸梭菌（≥1×106 CFU/g），发现地衣芽孢杆菌、屎肠球菌和丁酸梭菌均显著（P0.05）降低滴水损失率和蒸煮损失率。陶强强等[14]将磷酸、乳酸、柠檬酸和赋形剂组成酸化剂，利用1日龄爱拔益加肉仔鸡，对照组，试验Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组在基础日粮中分别添加（100、150和200 mg/kg）酸化剂，试验6周。结果显示，试验组肉鸡胸肌剪切力显著降低，添加150 mg/kg酸化剂显著（P＜0.05）升高腿肌pH值，添加150、200 mg/kg酸化剂显著降低腿肌剪切力。张瑞琨等[15]研究利用罗斯308肉公鸡，设对照组，试验组（在基础日粮中添加1×106 CFU/g丁酸梭菌），饲养42 d，结果显示，丁酸梭菌能够显著降低腿肌滴水损失。本研究结果表明，大枣多糖能够降低胸肌失水率、滴水损失和蒸煮损失，提高pH值和红度（a*）；能够降低腿肌失水率、剪切力和滴水损失，提高红度（a*），与上述结果相一致。4结论大枣多糖可以通过调节血清中细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ mRNA相对表达量，来影响细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ的分泌，从而发挥其免疫功能；可以通过降低失水率、剪切力、滴水损失和蒸煮损失，提高pH值和红度（a*），改善肉品质。在基础日粮中添加2 g/kg大枣多糖效果最佳。