植物多糖具有免疫调节、抗菌、抗病毒、抗辐射、抗肿瘤、降血糖和降血脂等作用,但大枣多糖在饲料添加剂中的研究鲜有报道,大枣多糖具有免疫调节、抗氧化和抗衰老等作用[1-3]。本研究在肉鸡基础日粮中添加不同浓度的大枣多糖,探讨大枣多糖对鸡免疫功能和肉品质的影响,旨在为大枣多糖在肉鸡生产上的应用与推广提供参考。1材料与方法1.1试验动物1日龄爱维因肉鸡雏由锦州鸿强牧业有限公司提供。1.2试验日粮雏鸡饲料由大成农技(葫芦岛)有限公司生产,主要原料有玉米、豆粕、棉籽粕、鱼粉、碳酸氢钙、石粉、氯化钠、微量元素(硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸锰、硫酸锌和亚硒酸钠)、维生素(VA、VD3、VE、VK3、VB2和VB12)、氯化胆碱和功能性氨基酸(L-赖氨酸、DL-蛋氨酸、L-苏氨酸、L-苏氨酸和赖氨酸)。营养含量:粗蛋白20%、水分14%、粗灰分8%、粗纤维6%、赖氨酸1%、总磷0.55%、蛋氨酸0.42%~0.89%、氯化钠0.3%~0.8%和钙0.06%~1.20%。1.3药品及试剂大枣多糖购自晨光生物技术有限公司,纯度≥90%;盐酸左旋咪唑、鸡外周血淋巴细胞分离液试剂盒,购自北京索莱宝科技有限公司;胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司;鸡白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)和干扰素-γ(IFN-γ)试剂盒购自上海岚派生物科技有限公司;异丙醇和冰乙醇购自山东旭晨化工科技有限公司;TaKaRa逆转录试剂盒和TB Green™ Premix Ex Taq™ II(Tli RNaseH Plus)试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司;Trizol、Geletcin、marke、TAE(50x)和Invitrogen购自碧云天生物技术有限公司。1.4试验设计与饲养方法试验选用1日龄肉鸡雏300只,分成5组,每组3个重复,每个重复20只鸡。设KB组、YX组、1DT组、2DT组和4DT组。KB组肉鸡饲喂基础日粮,YX组在基础日粮中添加0.2 g/kg盐酸左旋咪唑,1DT组、2DT组和4DT组在基础日粮中分别添加1、2和4 g/kg大枣多糖。试验肉鸡网上饲养,自由饮水和采食,试验期42 d。1.5测定指标及方法1.5.1细胞因子含量参考马艳[4]、李晓丽[5]和毛亚芳等[6]试验方法,42日龄时,每组随机抽取3只鸡翅下静脉无菌采血2 mL,3 000 r/min离心10 min,制得血清。采用ELISA法测定血清中细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ含量,参考李贤等[7]试验方法进行检测,具体操作步骤按鸡ELISA检测试剂盒说明书进行。1.5.2IL-2、IL-4和IFN-γ mRNA表达量参考刘素贞等[8]试验方法,42日龄时,每组随机抽取3只鸡,翅下静脉无菌采取肝素抗凝血2 mL,加2 mL全血组织稀释液,移入含有3 mL淋巴细胞分离液的试管中。室温、750×g离心30 min。吸取白膜层至15 mL离心管中,加10 mL细胞洗涤液。室温、250×g离心10 min。弃上清,加5 mL细胞洗涤液再次重悬细胞。加4 mL完全培养基(胎牛血清∶RPMI-1640培养基=1∶9)。取90 µL加10 µL台盼蓝,注入玻片计数板上,利用倒置显微镜观察细胞活力至95%以上并用含10%血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为5×106个/mL。24孔细胞培养板中每孔加1 950 µL淋巴细胞悬液,每个样品重复两孔,在参数为37 ℃、CO2体积分数为5%及饱和湿度的CO2培养箱中培养12 h。1 500 r/min、4 ℃离心5 min,弃上清。加1 mL淋巴细胞洗涤液再洗涤2次。加1 mL trizol,12 000 r/min、4 ℃离心10 min,弃沉淀。加200 µL氯仿,剧烈摇晃30 s,冰浴10 min,12 000 r/min、4 ℃离心10 min。取上清500 µL,加500 µL异丙醇,轻柔颠倒8次,冰浴10 min,12 000 r/min、4 ℃离心10 min。弃上清。加1mL 75%冰乙醇,12 000 r/min、4 ℃离心10 min,弃上清,此操作进行2遍。冰浴风干30 min,加无RNA酶水(RNase-free水)20 μL溶解沉淀。取1 μL在超微量紫外可见分光光度计260 nm及280 nm波长处测定吸光度A的比值,记录Total RNA的浓度,若比值在1.8~2.1之间,表明提取的RNA纯度高,未被污染。按照TaKaRa逆转录试剂盒的说明书配制反应体系1见表1。反应条件:37 ℃,20 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.011.T001表1逆转录反应体系1组分体积/μLTotal10gDNA Eraser15X gDNA Eraser Buffer2RNA(1 μg/μL)1RNase Free dH2O6按照TaKaRa逆转录试剂盒的说明书配制反应体系2见表2。反应条件:37 ℃,15 min;85 ℃,5 s,得到cDNA样品-80 ℃保存[9]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.011.T002表2逆转录反应体系2组分体积/μLTotal20上述反应液105×PrimeScript Buffer2(for Real Time)4PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ1RT primer mix1RNase Free dH2O4试验引物核苷酸序列见表3,在Nucletide BLAST中进行序列比对,引物由TaKaRa公司合成。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.011.T003表3PCR引物设计引物引物序列(5'-3')长度/bpIL-2 FTTCATCTCGAGCTCTACACACCAA181IL-2 RGCATTCACTTCCGGTGTGATTTAIL-4 FGCGTCAAGATGAACGTGACAGA147IL-4 RGGAGCTGACGCATGTTGAGGIFN-γ FAGCATTTGAACTGAGCCATCACC200IFN-γ RCCGTCAGCTACATCTGAATGACTTGβ-actin FATTGTCCACCGCAAATGCTTC113β-actin RAAATAAAGCCATGCCAATCTCGTC按照TB GreenTM Premix Ex TaqTM II (Tli RNaseH Plus)试剂盒的说明配制反应体系见表4。反应条件:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s(40个循环),60 ℃ 30 s(40个循环)[10]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.011.T004表4Real-time PCR反应体系组分体积/μLTotal25.0SYBR Premix EX Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2X)12.5Primer F(10 μmol)1.0Primer R(10 μmol)1.0cDNA*2.0dH2O8.5以β-actin为内参基因,扩增完后在实时定量PCR仪上测定目的基因表达水平,使用2-ΔΔCt方法定量。数据取3次重复的平均值。从而得到目的基因IL-2、IL-4和IFN-γ的mRNA表达量。反应结束后进行电泳检测:第一道上7 μL marker,其余道上8 μL PCR产物,在电压110 V条件下进行电泳,35 min后,使用凝胶成像系统检测结果。1.5.3肉品质在42日龄测定失水率、剪切力、滴水损失、蒸煮损失、pH值和肉色亮度(L*)、红度(a*)和黄度(b*)[11-12]。1.6数据统计与分析数据使用统计软件SPSS 13.0进行一维方差分析,结果以“平均值±标准差”表示,P0.05表示差异显著,P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1大枣多糖对肉鸡细胞因子含量及mRNA表达量的影响(见表5、图1~图3)10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.011.F001图1IL-2 mRNA电泳图谱注:ACTB组:1.marker; 2.KB组;3.YX组;4. 1DT组;5. 2DT组;6. 4DT组。IL-2组:7.KB组;8.YX组;9.1 1DT组;10. 2DT组;11. 4DT组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.011.F002图2IL-4 mRNA电泳图谱注:ACTB组:1.marker; 2.KB组;3.YX组;4. 1DT组;5. 2DT组;6. 4DT组。IL-4组:7.KB组;8.YX组;9.1 1DT组;10. 2DT组;11. 4DT组。由表5、图1~图3可知,YX组、1DT组、2DT组和4DT组肉鸡的IL-2、IL-4和IFN-γ含量及mRNA表达量均极显著高于KB组(P0.01);2DT组极显著高于1DT组和4DT组(P0.01)。研究表明,大枣多糖能够提高促进IL-2、IL-4和IFN-γ分泌及mRNA表达量,2DT组效果最佳。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.011.T005表5大枣多糖对肉鸡细胞因子含量及mRNA表达量的影响(n=3)项目KB组YX组1DT组2DT组4DT组细胞因子/(ng/L)IL-247.19±0.68Dd78.65±0.45Aa69.98±1.14Bb77.62±0.26Aa66.38±0.97CcIL-432.12±0.73Cc48.84±1.22Aa38.73±0.85Bb48.73±1.13Aa40.06±0.99BbIFN-γ11.34±1.74Cc26.99±0.52Aa16.87±0.39Bb25.59±1.523Aa18.09±2.44BbmRNAIL-2 mRNA1.00±0Cc7.23±0.54Aa4.64±1.24Bb7.00±0.60Aa4.57±0.57BbIL-4 mRNA1.00±0Cc8.59±0.11Aa5.57±0.65Bb8.32±0.82Aa6.45±0.04BbIFN-γ mRNA1.00±0Cc7.31±0.86Aa5.19±0.46Bb7.08±1.07Aa5.08±0.28Bb注:同行数据肩标小写字母不同表示差异显著(P0.05),大写字母不同表示差异极显著(P0.01),字母相同或无字母表示差异不显著(P0.05);下表同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.011.F003图3IFN-γ mRNA电泳图谱注:ACTB组:1.marker; 2.KB组;3.YX组;4. 1DT组;5. 2DT组;6. 4DT组。IFN-γ组:7.KB组;8.YX组;9.1 1DT组;10. 2DT组;11. 4DT组。2.2大枣多糖对肉鸡肉品质的影响(见表6)由表6可知,1DT组、2DT组和4DT组胸肌和腿肌失水率极显著低于KB组和YX组(P0.01)。KB组、YX组、1DT组、2DT组和4DT组胸肌剪切力均差异不显著(P0.05);1DT组和2DT组腿肌剪切力显著低于KB组、YX组和4DT组(P0.05)。1DT组和2DT组胸肌和腿肌滴水损失均显著低于KB组、YX组和4DT组(P0.05)。2DT组胸肌蒸煮损失显著低于KB组、YX组、1DT组和4DT组(P0.05);KB组、YX组、1DT组、2DT组和4DT组腿肌蒸煮损失均差异不显著(P0.05)。1DT组和2DT组胸肌pH值均显著高于KB组、YX组和4DT组(P0.05);KB组、YX组、1DT组、2DT组和4DT组腿肌pH值均差异不显著(P0.05)。KB组、YX组、1DT组、2DT组和4DT组胸肌和腿肌亮度(L*)和黄度(b*)均差异不显著(P0.05)。1DT组、2DT组和4DT组胸肌和腿肌红度(a*)极显著高于KB组(P0.01),显著高于YX组(P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.011.T006表6大枣多糖对肉鸡肉品质的影响(n=3)项目KB组YX组1DT组2DT组4DT组胸肌失水率/%11.21±0.58Aa10.53±0.57Aa7.20±0.83Bb6.38±0.76Bb7.30±0.14Bb剪切力/N3.62±0.08Aa3.60±0.08Aa3.59±0.03Aa3.59±0.07Aa3.61±0.08Aa滴水损失/%2.78±0.20Aa2.60±0.68Aa1.87±0.30Ab1.86±0.51Ab2.73±0.26Aa蒸煮损失/%32.52±1.86Aa29.67±2.04Aa29.20±1.06Aa27.86±0.12Ab30.08±1.65AapH值6.65±0.04Ab6.70±0.10Ab6.77±0.06Aa6.81±0.02Aa6.68±0.03Ab亮度(L*)/%29.85±1.72Aa29.85±1.47Aa32.68±0.35Aa34.08±1.16Aa30.33±0.60Aa红度(a*)/%2.33±0.10Bb2.38±0.31Bb7.48±0.39Aa8.03±1.87Aa6.80±0.86Aa黄度(b*)/%22.63±1.88Aa22.08±0.63Aa20.63±0.71Aa19.53±2.97Aa20.95±0.57Aa腿肌失水率/%8.67±1.07Aa8.14±0.57Aa5.48±0.35Bb5.30±0.36Bb6.22±0.96Bb剪切力/N3.72±0.07Aa3.61±0.02Aa3.60±0.04Ab3.56±0.10Ab3.68±0.05Aa滴水损失/%2.64±0.20Aa2.54±0.13Aa2.11±0.17Ab2.07±0.25Ab2.58±0.26Aa蒸煮损失/%32.15±2.23Aa29.26±1.67Aa28.98±1.03Aa28.88±0.75Aa29.57±2.01AapH值6.75±0.03Aa6.75±0.03Aa6.79±0.02Aa6.79±0.04Aa6.77±0.01Aa亮度(L*)/%32.08±2.56Aa32.10±2.29Aa32.83±0.63Aa35.05±0.69Aa32.30±0.53Aa红度(a*)/%7.00±1.44Ab7.00±0.57Ab12.00±0.12Aa10.83±1.15Aa8.88±2.19Aa黄度(b*)/%23.28±2.41Aa22.60±0.78Aa21.48±0.92Aa20.53±0.83Aa21.75±0.84Aa研究表明,大枣多糖能降低胸肌失水率、滴水损失和蒸煮损失,提高pH值和红度(a*);能降低腿肌失水率、剪切力和滴水损失,提高红度(a*)。3讨论3.1大枣多糖对鸡免疫功能的影响淋巴细胞是机体的免疫活性细胞,只有在受抗原刺激后才能激活产生特异性免疫应答。淋巴细胞包括参与体液免疫的B细胞和参与细胞免疫的T细胞,细胞因子分泌是T细胞活化的重要标志。细胞因子主要参与细胞间信息的传递,细胞生长和分化,疾病的发生,影响机体的免疫调节作用。李凤娇等[3]研究体外分离小鼠脾淋巴细胞,设计空白组、阳性对照组(左旋咪唑)以及不同质量浓度的大枣多糖组(终浓度为20、40、80、160 和320 mg/L),MTT法观察大枣多糖对小鼠淋巴细胞增殖的影响情况;采用ELISA法观察大枣多糖对小鼠淋巴细胞上清液中 IL-2、IL-6、IL-10、IL-12水平的影响;QRT-PCR检测大枣多糖对小鼠淋巴细胞 IL-2、IL-6、IL-10、IL-12 mRNA表达的影响,结果显示,大枣多糖能够促进脾淋巴细胞增殖,促进淋巴细胞Th1型细胞因子IL-2和IL-12,Th2型细胞因子IL-6和IL-10分泌及其mRNA的表达。本研究中,鸡血清中IL-2、IL-4和IFN-γ分泌量和mRNA表达量YX组、1DT组、2DT组和4DT组均极显著高于KB组,表明大枣多糖能促进血清中IL-2、IL-4和IFN-γ的分泌及mRNA表达量,与上述结果相一致。大枣多糖可活化T细胞,提高血清中IL-2、IL-4和IFN-γ mRNA相对表达量,来影响IL-2、IL-4和IFN-γ分泌,从而发挥其免疫功能。3.2大枣多糖对鸡肉品质的影响刁蓝宇等[11]将乳酸、富马酸、高活性乳酸杆菌和恩拉霉素预混剂配制成酸化剂与益生菌混合制剂,利用84日龄广西三黄鸡,设对照组、不同浓度酸化剂与益生菌混合制剂组(在每千克基础日粮添加1 g和2 g酸化剂与益生菌混合制剂),饲喂6 d,饲养至118日龄屠宰,添加2 g酸化剂与益生菌混合制剂能够显著降低胸肌和腿肌的滴水损失。郑光耀等[12]将杨树皮提取物、木醋液和沸石粉配制成杨树皮提取物复方制剂,利用1日龄罗斯308肉鸡,设空白对照组,试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组(在基础日粮中添加 0.35%、1.75%和3.50%的杨树皮提取物复方制剂),饲养42 d,试验Ⅱ组和Ⅲ组的滴水损失率和蒸煮损失率均显著低于空白对照组。李可等[13]研究利用1日龄的爱拔益加肉仔鸡,设对照组,试验1组、2组和3组分别在日粮中添加地衣芽孢杆菌(≥3×106 CFU/g)、屎肠球菌(≥1×106 CFU/g)和丁酸梭菌(≥1×106 CFU/g),发现地衣芽孢杆菌、屎肠球菌和丁酸梭菌均显著(P0.05)降低滴水损失率和蒸煮损失率。陶强强等[14]将磷酸、乳酸、柠檬酸和赋形剂组成酸化剂,利用1日龄爱拔益加肉仔鸡,对照组,试验Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组在基础日粮中分别添加(100、150和200 mg/kg)酸化剂,试验6周。结果显示,试验组肉鸡胸肌剪切力显著降低,添加150 mg/kg酸化剂显著(P<0.05)升高腿肌pH值,添加150、200 mg/kg酸化剂显著降低腿肌剪切力。张瑞琨等[15]研究利用罗斯308肉公鸡,设对照组,试验组(在基础日粮中添加1×106 CFU/g丁酸梭菌),饲养42 d,结果显示,丁酸梭菌能够显著降低腿肌滴水损失。本研究结果表明,大枣多糖能够降低胸肌失水率、滴水损失和蒸煮损失,提高pH值和红度(a*);能够降低腿肌失水率、剪切力和滴水损失,提高红度(a*),与上述结果相一致。4结论大枣多糖可以通过调节血清中细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ mRNA相对表达量,来影响细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ的分泌,从而发挥其免疫功能;可以通过降低失水率、剪切力、滴水损失和蒸煮损失,提高pH值和红度(a*),改善肉品质。在基础日粮中添加2 g/kg大枣多糖效果最佳。
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