饲用酶制剂能够促进动物生长，提高饲料转化率，调节肠道健，在畜牧行业中的应用越来越广泛[1-2]。葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）是一种需氧脱氢酶，能够在氧气存在时催化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖酸可以降低胃肠道内酸性，有利于抑制病原菌；过氧化氢具有广谱杀菌的功效，能够抑制大肠杆菌、沙门氏菌等致病微生物的生长[3-4]。目前,可以从多方面对饲用酶制剂进行评价[5]。大量研究表明，葡萄糖氧化酶能够提高动物生产性能，保护肠道健康，增强动物的免疫力以及调节肠道健康[6-8]。但是，体外应用评估试验相关文献较少。因此，本试验通过研究其对大肠杆菌抑菌效果、产酸能力、耐温性以及对人工消化液的耐受性，为葡萄糖氧化酶在畜牧业中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验酶菌饲用葡萄糖氧化酶产品由河北省微生物研究所提供，酶活含量为2 000 U/g（酶活定义为：在35 ℃、pH值5.1，每分钟内从过量底物中释放1 μmol产物所需的酶量定义为1个酶活力单位，即1 U），依照高庆华等[9]方法进行测定。大肠杆菌（货号BNCC337302）购自北京北纳创联生物技术研究院。1.1.2培养基与试剂LB固体和液体培养基购自索莱宝科技有限公司。葡萄糖、胃蛋白酶（猪来源）、胰蛋白酶（猪来源）均购自Sigma公司。1.1.3试验仪器SW-CJ-2FD型洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、SN510C型压力蒸汽灭菌锅（重庆雅马拓科技有限公司）、BSP-150型生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、ZWY-240型恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造公司）、pH5F型平面笔式pH计（上海三信仪表厂）、DZKW-4型电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）、L3S型可见分光光度计（上海精密仪器仪表有限公司）。1.2试验方法1.2.1菌液的制备取低温保存大肠杆菌，使用接种针蘸取少量菌液，于LB固体培养基划线培养，37 ℃培养24 h。挑取单菌落于LB液体培养基中，37 ℃培养15~18 h，OD600 nm在2.5~3.0，将菌液倒入灭菌离心管中，4 ℃保存备用。1.2.2抑菌试验1.2.2.1不同浓度条件下GOD抑菌试验取4 ℃保存大肠杆菌菌液，吸取100 μL菌液均匀涂布于制备好的LB固体培养皿上，静置5 min。将GOD使用灭菌乙酸盐缓冲液（pH值5.1）分别稀释成20.0、15.0、10.0、5.0、2.5 U/mL，将稀释好的酶液分别与等体积0.1 g/mL葡萄糖溶液（GS）混合均匀，采用牛津杯抑菌试验方法进行抑菌试验。在培养皿中等距离放置灭菌牛津杯，加入200 μL GOD与GS的混合液，然后将培养皿置于37 ℃恒温培养箱培养24 h，测定抑菌圈直径，每个样品做3个平行[10]。1.2.2.2不同pH值条件下GOD抑菌试验将GOD分别使用pH值为3、4、5、6、7的乙酸盐缓冲液稀释为酶活20 U/mL，采用牛津杯法进行抑菌试验。1.2.3GOD体外产酸试验利用pH计测定配制好的0.2 g/mL葡萄糖溶液pH值作为起始值。称取适量GOD干粉于100 mL、0.2 g/mL葡萄糖溶液中，至终酶活为1.0 U/mL，置于恒温振荡箱39 ℃、150 r/min振荡。每隔1 h测量溶液pH值。每个样品做3个平行。1.2.4GOD耐温试验称取待测固体酶样1 g，准确到0.001 g，加入50 mL缓冲液（根据酶活测定标准所定缓冲液），磁力搅拌30 min后得到溶解液。取5 mL溶解液加入已经在测定温度下预热5 min的离心管中，置于测定温度（70、75、80、85 ℃）的水浴锅内分别处理1、3、5 min（精准计时），立即取出离心管放入冰水中冷却至室温，得到不同温度处理液。适当稀释后，测定特定温度、时间处理后的酶活。以未进行热处理的样品做空白对照，对应酶活作为基础酶活，分别计算各温度梯度、处理时间后的相对剩余酶活（%），即耐温存留率。每个处理3个重复。1.2.5消化液耐受试验1.2.5.1配制人工消化液人工胃液，即胃蛋白酶液：使用pH值2.5的盐酸溶液溶解胃蛋白酶（猪源）标准品，配制成50 g/L胃蛋白酶溶液人工肠液，即胰蛋白酶溶液：使用pH值6.5的磷酸缓冲溶液溶解胰蛋白酶（猪源）标准品，配制成50 g/L胰蛋白酶溶液1.2.5.2耐人工胃液的测定称取一定量GOD干粉加入100 mL，pH值2.5的盐酸缓冲液，磁力搅拌30 min后得到溶解液。取溶解液4 mL与1 mL胃蛋白酶溶液混合于10 mL离心管中，在37 ℃水浴摇床下进行反应，在1、2、3、4 h时测定GOD酶活。将以上测定的酶活与不加处理测得的酶活进行比较，计算酶活残存率。1.2.5.3耐人工肠液的测定称取一定量GOD干粉加入100 mL，pH值6.5的磷酸缓冲液，磁力搅拌30 min后得到溶解液。取溶解液4 mL与1 mL胰蛋白酶溶液混合与10 mL离心管中，在37 ℃水浴摇床下进行反应，在1、2、3、4 h时测定GOD酶活。将以上测定的酶活与不加处理测得的酶活进行比较，计算酶活残存率。1.3数据统计与分析使用SPSS 20.0软件One-Way ANOVA对数据进行方差分析，采用LSD法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1GOD对大肠杆菌的抑制效果不同浓度GOD混合液抑制大肠杆菌抑菌效果见表1。不同pH值GOD混合液抑菌效果见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.020.T001表1不同浓度GOD混合液对大肠杆菌抑菌效果GOD浓度/(U/mL)抑菌圈直径/cm20.01.63±0.15a15.01.53±0.15ab10.01.37±0.25ab5.01.30±0.15ab2.51.23±0.11b注：同列数据肩标字母不同表示差异显著（P0.05），字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.020.T002表2不同pH值GOD混合液抑菌效果pH值抑菌圈直径/cm32.45±0.19a42.13±0.10b51.97±0.05c61.85±0.13c72.17±0.16b由表1可知，不同浓度GOD均有较强抑菌作用。随着GOD浓度的降低，对大肠杆菌的抑菌圈直径相应逐渐变小，且在一些浓度之间出现显著差异（P0.05）。由表2可知，随着pH值的升高，GOD对大肠杆菌抑菌效果呈现出先减弱后增强的趋势。当pH值为3时，GOD抑菌效果最明显，与pH值4、5、6、7的抑菌效果差异显著（P0.05）。2.2GOD体外产酸对pH值的影响（见表3）由表3可知，随着反应时间的延长，GOD产酸效果越来越明显，pH值由最初6.67逐渐下降至2.67，在试验1~7 h时，pH值差异均显著（P0.05），第7、8 h差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.020.T003表3GOD体外产酸对pH值的影响时间/hpH值06.67±0.03a13.64±0.03b23.22±0.01c33.01±0.01d42.89±0.01e52.79±0.01f62.73±0.01g72.69±0.01h82.67±0.01h2.3温度对GOD酶残存率的影响（见表4）由表4可知，温度对GOD活性的影响较大，随着温度升高以及作用时间延长，酶活残存率逐渐降低，并且差异显著（P0.05）。70、75、80、85 ℃反应1 min后酶活残存率均显著性下降（P0.05）。随着反应时间的延长，70 ℃反应3 min和5 min后，酶活残存率分别为39.57%和14.25%，85 ℃反应3 min和5 min后，葡萄糖氧化酶酶活残存率均不足1%，酶活损失较大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.020.T004表4温度对GOD酶活残存率的影响时间/min70 ℃75 ℃80 ℃85 ℃187.75±1.14a69.14±0.76a51.02±0.91a25.83±0.33a339.57±0.87b15.19±0.63b1.68±0.32b0.15±0.06b514.25±0.48c4.15±0.45c0.30±0.06c0.07±0.01c%2.4人工消化液对GOD酶活残存率的影响（见表5）由表5可知，随着人工消化液处理时间的延长，GOD酶活活性不断下降，虽然出现显著性差异，但总体下降幅度不大。在人工胃液中，处理时间为1 h和2 h时酶活活性没有显著性变化（P0.05），在3 h和4 h酶活显著性下降（P0.05），和1 h相比酶活残留率最终下降8.57%。在人工肠液中，反应1 h和2 h GOD酶活显著性下降（P0.05），3 h和4 h后酶活下降幅度不大，与1 h相比，酶活残留率最终下降13.21%。GOD在人工胃液中的耐受性更好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.09.020.T005表5人工消化液对GOD酶活残存率的影响时间/h人工胃液人工肠液184.51±0.79a82.44±0.88a282.97±0.71a78.73±0.63b379.50±1.27b73.54±1.79c477.27±1.15c71.55±1.84c%3讨论3.1GOD抑菌产酸效果抑制肠道内有害菌的生长能够促进动物肠道健康，提高饲料转化率。很多抗生素替代品的研发基于抑菌能力来展开，如活菌制剂、发酵中草药[11-12]等。因此，抑菌试验对抗生素替代品的研发具有重要作用。大肠杆菌是动物肠道中主要的有害菌。葡萄糖氧化酶以葡萄糖为底物发生反应产生葡萄糖酸和过氧化氢。生成的葡萄糖酸能够降低pH值。过氧化氢也具有杀菌作用。在本研究中，随着GOD浓度的升高其抑菌作用增强，主要原因是GOD会破坏细菌的细胞膜和胞内蛋白[13]，反应产生的过氧化氢会增强GOD的抑菌作用。动物的消化系统内，pH值变化范围较大。因此，在不同pH值条件下的抑菌试验对于GOD的使用具有指导意义。产酸试验发现，GOD产酸效果明显，酸性环境有利于乳酸菌等有益菌的生长。在动物应用试验中，崔细鹏等[14]在肉鸡日粮中添加葡萄糖氧化酶，发现添加GOD可以显著提高肉鸡全期日增重及料重比，显著降低回肠pH值。陈清华等[15]研究发现，试验组添加GOD后，仔猪胃以及回肠中大肠杆菌数量显著低于对照组。GOD在反应过程中会消耗氧气，大部分有益菌为厌氧菌，有害菌为好氧菌，厌氧的环境对有害菌的繁殖起到抑制作用，有利于有益菌的生长。3.2GOD对温度及人工消化液的耐受性酶活性是用来衡量饲用酶制剂品质好坏的指标之一。在饲料制粒过程中酶制剂会经过高温高压处理，一般饲料造粒温度为70~80 ℃，时间为30 s~2 min[16]，有必要研究酶制剂的耐温性。不同来源的酶制剂耐温性不同[17-18]。GOD热稳定性差是限制其在饲料工业中广泛应用的因素之一。在本研究中，70 ℃反应1 min后酶活回收率为87.85%，反应3 min后剩余14.25%的酶活，85 ℃反应1 min后回收率仅25.83%，酶活下降明显。目前，GOD热稳定较好的菌株在70 ℃下热处理10 min后剩余63%的酶活[19]，但离饲料制粒高温的要求还是有一定差距。因此，GOD的热稳定性改良工作依然是后续研究的重点。GOD作为一种蛋白质，在动物应用试验中，动物肠胃中的内源消化酶，例如胃蛋白酶和胰蛋白酶会对其稳定性产生影响，从而影响养分消化率[10]。本研究中，随着试验处理时间的延长，相比胰蛋白酶液，GOD在胃蛋白酶液中耐受性更强，但二者酶活下降幅度不大。这是因为GOD是具有生物活性的蛋白质，在酸性以及蛋白酶的作用下被降解，使GOD酶活活性下降。与单春乔等[10]的研究相比，本试验GOD在胃蛋白酶液和胰蛋白酶液的反应时间延长至4 h，剩余酶活相对较高，主要原因是GOD的来源不同，酶性质也不同，并且不同pH值和不同浓度的消化酶发挥的效果不同。4结论GOD对大肠杆菌的抑菌能力随浓度增高而增强；pH值3~7时GOD有较好抑菌效果；随着反应时间的延长，GOD产酸效果明显；高温对GOD酶活活性影响较大，GOD对于人工消化液的耐受性较好。