中药制剂具有天然、安全、药效温和等优点[1]，且能够有效提高机体免疫力[2]、抑制病原微生物活性[3]。因为中草药的低毒性、低耐药性[4]、低刺激性等特性，近年来中草药制剂的应用一直是养殖业关注的热点。天冬糖苷散是通过中兽医辩证论治，并结合现代药理学研究而配伍成的组方，研制出的中兽药复方制剂。方中天冬有养阴润燥、清肺生津之功效，常用于肺燥干咳、内热消渴[5]；三七有止血化瘀、活血定痛之功效[6]。从天冬和三七中提取的有效成分对试验动物均有良好的免疫增强功效[7]。前期研究结果表明，天冬糖苷散具有提高动物免疫功能的作用，可用于因环境应激导致的免疫力低下的南美白对虾养殖中。文章旨在观察饲喂不同剂量天冬糖苷散对南美白对虾的安全性，从而提出受试药物的不良反应及临床应用时的注意事项，为天冬糖苷散临床应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料天冬糖苷散由广西大学基础药理学实验室研发，广西普大动物保健品有限公司中试生产，产品批号20190724，100 g/包。1.2试验动物南美白对虾450尾，体重（1.69±0.17）g，体长（4.84±0.22）cm，来自广西南美白对虾良种基地。南美白对虾临床表现健康、采食正常、虾线正常，暂养于室内直径300 L透明收纳箱内。水温（28±1）℃、pH值8、24 h充氧，养殖用水为海水配制，盐度为25.0‰，每天换水1次，换水量1/4。试验开始时放于300 L塑料箱中进行分组饲养；每天投喂4次（7：30、12：00、17：00、21：30)，每天投喂量为虾体重的3%~5%，投喂1 h时后，清除剩余饵料。1.3给药方式采用与临床应用相同的给药途径，拌饵投喂：将饵料粉碎，加入一定剂量的药物，混匀，再重新制粒，烘干（或者将药物和拌药剂一起溶解以后和饵料拌匀，烘干）。按照要求拌饵料，连用35 d，从喂药开始连续观察35 d。1.4试验设计450尾试验虾随机分为5组。设置1个空白对照组和4个试验剂量组，用药剂量分别为临床推荐剂量的1、3、5、10倍量。试验设计见表1.XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.07.001.T001表1试验设计Tab.1Test design组别动物数/尾处理空白对照组90不用药1倍剂量组90拌料饲喂，4 g/kg饲料连用35 d3倍剂量组90拌料饲喂，12 g/kg饲料连用35 d5倍剂量组90拌料饲喂，20 g/kg饲料连用35 d10倍剂量组90拌料饲喂，40 g/kg饲料连用35 d1.5临床体征试验期间观察南美白对虾是否出现与药物相关的不良反应，如体色、游动状态等情况变化。从给药开始连续观察35 d，记录南美白对虾是否出现死亡。若出现死亡，将死亡虾肝胰腺使用4%甲醛固定，用于石蜡固定，HE染色切片观察。1.6样品采集及前处理分别在给药第17 d、第35 d，每组取40尾虾，5%柠檬酸三钠无菌抗凝采集血淋巴，每2尾虾合成一个血液样品，2 000 r/min离心5 min，取上层血清，-20 ℃保存，用于血液生化指标分析；同时，采集肝胰腺，置于4%福尔马林固定，用于组织学观察。1.7测定指标及方法1.7.1生长性能分别于试验前、试验第17 d、第35 d对受试虾称体重、肝胰腺重量，量体长，计算其肝体比、体长增长率、体重增长率。肝体比=肝胰腺重量（g）×100/体重（g）（1）体长增长率=（末体长-初体长）/初体长×100%（2）体重增重率=（末体重-初体重）/初体重×100%（3）1.7.2血液生化指标取抗凝血用于检测肌酐（CRE）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、总蛋白（TP）、甘油三酯（TG）等指标，具体方法参考南京建成生物工程研究所相关试剂盒说明书。1.7.3病理组织学检查取4%甲醛固定后的肝胰腺，石蜡包埋切片、HE染色，镜检，拍照，观察肝胰腺中各细胞形态的变化。1.8数据统计与分析试验数据采用SPSS 22.0进行单因素方差分析，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1天冬糖苷散靶对南美白对虾体指数的影响（见表2）由表2可知，连续饲喂不同剂量天冬糖苷散17 d时，1倍剂量组南美白对虾体重、增重率、肝胰腺重量均显著高于对照组（P0.05）；3倍剂量组南美白对虾体长、增长率、肝胰腺重量均显著低于对照组（P0.05），10倍剂量组体长、增长率、体重、增重率均显著低于对照组（P0.05），但是其肝体比显著高于对照组（P0.05），体重显著低于其余各组（P0.05），但是肝体比显著高于其余各组（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.07.001.T002表2天冬糖苷散对南美白对虾体指数的影响Tab.2Effect of TianDongTangGan powder on Litopenaeus vannamei body index (n=40)时间/d组别体长/cm增长率/%体重/g增重率/%肝胰腺重/g肝体比/(g×100/g)0随机抽取4.84±0.22—1.69±0.17———17对照组6.06±0.34ab25.10±6.97ab3.36±0.46b98.59±27.13b0.17±0.03b5.06±0.67bc1倍剂量组6.10±0.35a26.08±7.26a3.77±0.62a122.78±36.40a0.20±0.03a5.30±0.73b3倍剂量组5.90±0.27c21.69±5.73c3.18±0.35b88.36±20.64b0.16±0.02c4.88±0.47c5倍剂量组5.96±0.30bc23.14±6.34bc3.39±0.58b100.41±34.12b0.17±0.03b5.19±0.72bc10倍剂量组5.75±0.21d18.75±4.41d2.91±0.32c72.29±18.94c0.17±0.03b5.78±0.83a35对照组7.09±0.27b46.44±5.68b5.54±0.65b227.83±38.49b0.19±0.04d3.41±0.46c1倍剂量组7.48±0.34a53.98±7.03a6.40±0.83a277.31±48.02a0.26±0.05a4.11±0.42b3倍剂量组7.09±0.44b46.33±9.05b5.53±0.97b225.24±58.39b0.24±0.05b4.41±0.60a5倍剂量组7.17±0.35b48.14±7.31b5.71±0.70b237.91±41.67b0.24±0.03b4.18±0.56b10倍剂量组6.91±0.23c42.77±4.77c5.08±0.56c200.40±33.20c0.21±0.03c4.16±0.47b注 ：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。连续饲喂不同剂量天冬糖苷散35 d时，1倍剂量组南美白对虾体长、增长率、体重、增重率显著高于对照组（P0.05）；各给药组肝胰腺重量、肝体比均显著高于对照组（P0.05）；10倍剂量组体长、增长率、体重、增重率均显著低于对照组（P0.05）。结果表明，连续饲喂35 d推荐剂量1、3、5倍的天冬糖苷散，可以不同程度地提高南美白对虾的体重、肝胰腺重量以及肝体比，促进其生长，1倍剂量效果最好，但10倍天冬糖苷散推荐剂量对南美白对虾生长有一定的影响。2.2天冬糖苷散靶对南美白对虾血液生化指标的影响（见表3）由表3可知，连续饲喂不同剂量天冬糖苷散17 d时，与空白对照相比，各给药组南美白对虾的血淋巴中肌酐、甘油三酯、总蛋白含量及谷丙转氨酶活性差异不显著（P0.05），5倍、10倍剂量组南美白对虾的血液中谷草转氨酶活性显著高于对照组（P0.05），1倍剂量组谷草转氨酶活性显著低于对照组（P0.05）；1倍、3倍、5倍、10倍剂量组尿素氮含量显著高于对照组（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.07.001.T003表3天冬糖苷散靶对虾血液生化指标的影响Tab.3Effect of TianDongTangGan powder on Litopenaeus vannamei blood biochemical indexes（n=20）时间/d组别肌酐/(μmol/L)甘油三酯/(mmol/L)谷草转氨酶/(U/L)谷丙转氨酶/(U/L)总蛋白/(mg/L)尿素氮/(mmol/L)17对照组50.62±16.540.45±0.2122.52±15.08c108.78±18.0543 552.81±19 938.42.37±0.71d1倍剂量组48.14±20.910.54±0.1912.79±5.20d106.60±43.5538 256.01±25 235.893.65±0.80c3倍剂量组49.91±12.710.54±0.1729.22±9.70bc112.65±36.2441 199.01±27 719.168.24±1.21a5倍剂量组49.2±17.480.49±0.1934.54±15.21ab119.74±36.5240 857.45±16 928.096.89±1.42b10倍剂量组49.08±10.40.61±0.2640.21±11.52a123.17±50.9142 358.04±27 373.286.27±0.98b35对照组88.64±30.54a0.59±0.12ab34.25±10.99ab94.09±29.33b54 537.46±10 766.01b1.25±0.39c1倍剂量组74.52±21.45ab0.56±0.21ab44.44±18.33a94.39±28.12b58 571.58±12 818.36b1.60±0.74bc3倍剂量组64.88±19.87b0.69±0.24a42.92±16.18a129.69±29.06a70 946.40±12 011.55a1.61±0.71bc5倍剂量组77.44±21.45ab0.43±0.16b28.41±12.51b92.74±39.97b63 048.14±15 202.12ab2.24±0.54a10倍剂量组67.44±24.23b0.47±0.21b30.68±10.24b85.47±39.04b62 437.16±9 662.39ab1.98±0.82ab连续饲喂不同剂量天冬糖苷散35 d时，只有5倍、10倍剂量组南美白对虾血液中的尿素氮含量显著高于对照组（P0.05）；在连续给药35 d时，3倍、10倍剂量组肌酐含量显著低于对照组（P0.05）。结果表明，在连续饲喂正常剂量不同倍数的天冬糖苷散35 d，5倍、10倍剂量对南美白对虾有一定的影响。2.3肝胰腺组织病理切片结果（见图1）由图1可知，在连续饲喂正常剂量不同倍数的天冬糖苷散后，各组肝胰腺形态于空白对照组相比，形态正常，仅10倍剂量组肝胰腺细胞与底膜分离间距增大，但其形态完整。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.07.001.F001图1第35 d肝胰腺病理切片图（HE，400 x）Fig. 35d hepatopancreas pathological section (HE, 400 x)3讨论天冬糖苷散是由天门冬多糖和三七总皂苷按照一定比例混合而成。方中天冬是一味具有治疗肺部疾病的常用中药，味苦、平，入肺肾经，主治阴虚发热、咳嗽吐血、肺痈、咽喉肿痛、便秘、小便不利等。现代药理学研究发现，天冬中含有甾体皂苷、多糖、氨基酸等有效成分，天门冬多糖是主要有效活性成分之一。李梦钰等[8]通过扫描电镜和原子力显微镜观察，发现天门冬多糖构象为球形聚集状、结构紧实；热学特性结果显示，天门冬多糖具有较高的热稳定性，为其多领域的开发提供参考依据。药效学研究表明，天门冬多糖可以活化巨噬细胞、显著增加单核-巨噬细胞的百分数、增强单核-巨噬细胞的吞噬能力、诱导分泌多种细胞因子促进炎症反应、增强机体的免疫应答[9]。赵怡等[10]研究发现，天门冬多糖能显著提高环磷酰胺免疫抑制小鼠血液中细胞因子IFN-γ的水平和脾脏指数，表明天门冬多糖具有增强小鼠免疫功能的作用。张文胜[11]研究表明，天门冬多糖对骨髓来源的抑制性细胞（MDSCs）和细胞系（MSC-2）均有明显的抑制作用；而对原代淋巴细胞却有促进作用。胡国明等[12]研究发现，天门冬多糖注射液能够明显增加试验鸡的平均日增重，促进鸡的生长发育，是一种有效、安全的免疫增强剂。三七总皂苷也是三七中发挥主要药效作用的活性物质，具有清除自由基、抗炎、免疫调节等作用。研究表明，三七总皂苷可以直接抑制线粒体中活性氧的生成与累积，从而提高抗氧化应激能力[13]。姜辉等[14]研究发现，三七总皂苷能显著抑制促炎因子的分泌，减轻大鼠肝纤维化程度，保护大鼠的免疫器官。冯晓异等[15]也发现，三七总皂苷可有效降低非酒精性脂肪肝大鼠转氨酶活性及血脂指标，同时可以抑制NO/iNOS/NF-κB信号通路，减少肝损伤。陈毓等[16]研究表明，三七总皂苷具有较好的安全性，且在体外具有一定的细胞免疫活性和诱生细胞因子的能力，为三七作为免疫调节剂的开发提供新的参考依据。以上研究均表明，天冬和三七总皂苷具有一定的抗炎和调节免疫能力的作用。实验室前期研究发现，天冬糖苷散具有提高南美白对虾免疫能力，并具有提高其抗急性氨氮应激的作用。靶动物安全性试验是新兽药临床试验研究的重要部分。采用不同剂量的天冬糖苷散饲喂南美白对虾，观察其精神状态等，检测生理、生化及体重等相关指标的变化，如肌酐、尿素氮、谷丙转氨酶、谷草转氨酶等指标数值的变化，评价天冬糖苷散对南美白对虾的生理、生化系统的影响，研究不同剂量天冬糖苷散对南美白对虾的不良反应，为提供天冬糖苷散的临床应用提供参考依据。在本试验中，将不同剂量的天冬糖苷散连续饲喂南美白对虾35 d后，1、3、5倍剂量组在一定程度上能促进南美白对虾的生长和肝胰腺发育水平；血液生化指标结果显示，1、3倍剂量组对南美白对虾血液生化指标及肝胰腺无显著影响。3、5倍剂量组尿素氮、肌酐数值偏高，而总蛋白数值平稳，说明天冬糖苷散对肝胰腺有一定的影响。此外，病理组织学切片结果显示，除10倍剂量组，各给药组与空白对照组无明显差别，肝胰腺细胞结构完整，无明显损伤；10倍剂量组虾肝胰腺细胞与底膜有明显分离，但仍结构完整、无破裂、坏死等现象。表明1~5倍剂量天冬糖苷散连续饲喂南美白对虾35 d，对肝胰腺无不良影响，安全性较好。4结论南美白对虾连续饲喂1、3、5倍临床推荐剂量的天冬糖苷散35 d后，可以提高南美白对虾的体长、增长率、体重、增重率和肝胰腺重量以及肝体比；10倍推荐剂量对南美白对虾生化及肝胰腺有一定的影响；但病理组织学切片结果显示，10倍剂量组肝胰腺无实质性的损伤。研究表明，天冬糖苷散在1~5倍临床推荐剂量下使用安全可靠。