腹泻病会使犊牛发病率和死亡率升高，严重影响犊牛后期生长发育和健壮程度，增加治疗和养殖成本，造成严重的经济损失[1]。抗生素对腹泻病治疗效果好，但易造成犊牛的耐药性和药物残留，危害人类健康[2]。蒙药作为蒙医药学的重要组成部分，具有低残留、低毒副作用和耐药性小的特点[3]，有望替代抗生素治疗大肠杆菌性腹泻[4]。草药饲料添加剂具有药物和营养两方面的作用，可以提高机体的免疫功能和生产性能，改善肉和乳品质，提高养殖经济效益[5]。草药添加剂可以显著提高肉鸡的生产性能、抗病能力等[6]。在犊牛饲料中添加草药添加剂可以促进犊牛生长[7]，但有关草药添加剂用于预防犊牛腹泻的报道较少。蒙兽药巴特尔-7属于经典组方，具有良好的抗病毒、抗炎[8]、镇痛[9]、增强免疫和治疗肠炎等效果。有研究表明，长期使用该组方中的银珠，存在用药风险，不可长期使用[10]。因此，本课题组对该组方进行优化，以优化后的复方为受试药物，以小鼠和大鼠为试验动物，研究蒙兽药巴特尔-7的急性和亚慢性毒性试验，以期对该复方的安全性做出科学评价，为其临床应用和日后作为饲料添加剂的研究方向提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验药物蒙兽药巴特尔-7由诃子、茜草和草乌叶等7味药按比例配伍组成（购自内蒙古呼和浩特市天力药业有限公司），使用500 mL蒸馏水浸泡30 min，文火煮沸30 min，过滤。药渣加蒸馏水250 mL，文火煮沸30 min，滤取药液。弃残渣，合并2次药液，文火煎煮蒸发至50 mL，制成生药含量1 g/mL Baatar-7水煎剂，4 ℃保存备用[11]。1.1.2试验动物80只健康SPF级昆明系小鼠，体重18~22 g；40只健康SPF级Wistar大鼠，体重110~130 g，均购自内蒙古大学试验动物中心，许可证号：SCXK（蒙2002-0001）。所有试验动物均饲养在无菌动物室，保持（22±2）℃、湿度55%±5%，光照/黑暗周期12 h[12]。试验前常规饲养3 d，自由采食、饮水，每周更换3次垫料。1.1.3试验仪器BC-2800vet全自动血液细胞分析仪（北京曼程科技有限公司）、BS-180vet生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）、奥林帕斯显微镜（赛默飞世尔科技有限公司）。1.2蒙兽药巴特尔-7小鼠急性毒性试验60只SPF小鼠随机分成6组，对照组（灌服0.2 mL/10 g·BW生理盐水）和Baatar-7剂量1~5组（分别1次性灌服5 000.0、2 500.0、1 250.0、625.0和312.5 mg/kg·BW Baatar-7药液）。给药前禁食12 h，自由饮水，给药1 h后自由采食，连续观察7 d。试验期间记录小鼠饮食、外观、死亡及中毒情况[13]。若小鼠未出现死亡，且无法再继续给药，需进行最大耐受量试验。1.3蒙兽药巴特尔-7小鼠最大耐受量试验SPF小鼠随机分成2组，对照组（灌服0.2 mL/10 g·BW生理盐水）和Baatar-7组（灌胃5 000 mg/kg·BW Baatar-7药液），每组10只（雌、雄各半），24 h给药2次（8：00和16：00），灌胃后常规饲养7 d，观察精神、食欲、饮水及其活动，记录中毒症状、死亡时间及数目。麻醉后颈椎脱臼处死并剖检，观察有无肉眼可见病变[14-15]。1.4蒙兽药巴特尔-7大鼠亚慢性毒性试验Wistar大鼠随机分成4组，对照组（灌服、2 mL/100 g·BW生理盐水）、Baatar7-L组、Baatar7-M组和Baatar7-H组（分别按2.5、5.0、10.0 g/kg·BW灌服Baatar-7药液，2 mL/100 g·BW），1次/d，连续给药6 w，试验前观察1 w，每周1次称重，依体重变化调整药量。试验前称重和编号，给药前空腹12 h。试验期每天观察记录大鼠的行为、精神状态、进食、粪便、毛色等一般状况。连续给药6 w后，禁食12 h，心脏采血，进行血液学检查，分离血清，进行血液生化学检查；大鼠采血后，麻醉处死，剖检；取肝、脾和肾，称湿重以计算脏器指数[16]。1.5测定指标及方法1.5.1体重于给药前及给药第1、2、3、4、5、6 w测定并记录大鼠体重[17-18]。1.5.2血常规及血液生化指标采用全自动血液细胞分析仪测定血液中红细胞数（RBC）、白细胞数（WBC）、血小板数（PLT）、血红蛋白含量（HGB）、淋巴细胞百分比（Lymph%）、中性粒细胞百分比（Gran%）等[19]。采用自动血液生化分析仪测定：谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、碱性磷酸酶（ALP）、血糖（GLU）、尿素氮（BUN）、总胆固醇（TCHO）、肌酐（CREA）等指标[20]。1.5.3病理变化及脏器指数大鼠采血后，立即处死，剖胸腹腔，肉眼观察各脏器有无异常并记录。取肝、脾和肾称湿重计算脏器指数。脏器采用10%福尔马林固定，不同梯度酒精级脱水、浸蜡包埋后切片，HE染色，在光镜下观察各器官组织病变[21]。脏器指数=脏器重量/体重×100% (1)1.6数据统计与分析数据采用SPSS 22.0进行方差分析，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1蒙兽药巴特尔-7小鼠急性毒性试验（见表1）由表1可知，灌服不同剂量的Baatar-7，给药后观察7 d，小鼠未出现死亡，其饮食和外观均未发现异常。由此可知，该药物的LD50无法计算得出（LD5010 000 mg/kg），根据急性毒性试验指导原则，当LD505 000 mg/kg，可以认为该药物实际无毒。受给药体积和药物浓度的限制难以测出LD50，因此进行小鼠的最大耐受量试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.001.T001表1蒙兽药巴特尔-7小鼠急性毒性试验组别药物浓度/(g/mL)给药体积/(mL/10 g·BW)给药剂量/(mg/kg·BW)死亡率/%对照组00.200Baatar-7剂量1组0.250 0000.25 000.00Baatar-7剂量2组0.125 0000.22 500.00Baatar-7剂量3组0.062 5000.21 250.00Baatar-7剂量4组0.031 2500.2625.00Baatar-7剂量5组0.015 6250.2312.502.2蒙兽药巴特尔-7小鼠最大耐受量试验（见表2）由表2可知，小鼠未表现出死亡和中毒等现象，且饮食和饮水等正常，剖检未见明显的病理变化。因此。可以判定Baatar-7为安全实际无毒。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.001.T002表2蒙兽药巴特尔-7小鼠最大耐受量试验组别药物浓度/(g/mL)单次给药剂量/(mg/kg·BW)给药次数给药总量/(mg/kg·BW)死亡率/%对照组00200Baatar-7组0.255 000210 00002.3蒙兽药巴特尔-7大鼠亚慢性毒性试验2.3.1蒙兽药巴特尔-7对大鼠体重的影响（见表3）由表3可知，与对照组比，Baatar-7各剂量组大鼠在试验期饮食、活动、精神、毛发光泽、粪便均正常，生长发育良好，口、眼、耳鼻均无异常分泌物，未见异常，无死亡，体重与对照组无显著差异（P0.05）。该结果说明Baatar-7对大鼠生长发育无显著影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.001.T003表3蒙兽药巴特尔-7对大鼠体重的影响组别0 w1 w2 w3 w4 w5 w6 w对照组150.71±28.86173.35±27.56183.44±28.88199.93±45.24215.38±47.36232.80±46.03241.11±45.25Baatar7-L组151.23±14.61178.86±20.55192.53±24.24209.10±23.15229.66±33.24231.93±29.72234.30±26.58Baatar7-M组155.30±4.92179.13±17.55194.98±19.74215.50±28.03240.06±39.38244.17±40.37249.99±45.22Baatar7-H组160.05±8.09173.86±23.72186.94±24.05210.15±30.16234.61±45.67234.83±45.02233.52±46.33注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同小写字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表4、表6与此同。g2.3.2蒙兽药巴特尔-7对大鼠的外周血液生理指标的影响（见表4）由表4可知，与对照组比，Baatar-7高、中、低3个剂量组中大鼠的RBC、WBC、PLT数量、HGB含量、Lymph百分比、Gran百分比均无显著性差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.001.T004表4蒙兽药巴特尔-7对大鼠外周血液生理指标的影响组别WBC/(×109/L)RBC/(×1012/L)PLT/(×109/L)HGB/(g/L)Lymph/%Gran/%对照组4.03±0.986.92±0.191 214.83±104.07135.33±6.7475.32±3.2121.12±1.42Baatar7-L组5.52±2.256.77±1.661 186.67±53.65123.83±31.4374.73±1.8026.37±3.44Baatar7-M组3.80±0.886.16±1.591 020.17±55.85113.83±30.3675.82±4.6826.17±8.67Baatar7-H组5.23±1.766.17±1.381 215.83±55.22118.50±28.4375.05±3.1322.57±3.012.3.3蒙兽药巴特尔-7对大鼠的血液生化学指标的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，Baatar-7低、中、高剂量组大鼠ALT、AST、ALP活性及TP、ALB、GLU、BUN、TCHO、CREA含量未发生显著变化（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.001.T005表5蒙兽药巴特尔-7对大鼠的血液生化指标的影响项目对照组Baatar7-L组Baatar7-M组Baatar7-H组ALT/(U/L)34.39±7.0730.23±2.8135.26±7.2133.46±8.00AST/(U/L)104.61±20.15104.19±14.00101.85±20.68118.81±10.61TP/(g/L)44.25±3.8847.43±5.6247.48±8.8643.29±3.30ALB/(g/L)28.95±1.5930.60±2.3130.53±3.0228.61±1.73ALP/(U/L)140.10±45.36109.60±35.63128.36±46.14116.68±42.94TCHO/(mmol/L)1.71±0.341.60±0.301.88±0.471.64±0.18GLU/(mmol/L)3.84±0.854.05±0.873.45±0.593.36±1.50BUN/(mmol/L)7.82±1.018.37±1.738.47±1.148.52±1.07CREA/(μmol/L)48.64±2.6150.64±2.4049.81±2.6749.41±2.79注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同小写字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.3.4蒙兽药巴特尔-7对大鼠脏器指数的影响（见表6）由表6可知，与对照组相比，Baatar-7高、中、低剂量组大鼠脏器指数无显著差异（P0.05），说明Baatar-7对大鼠脏器无实质性损伤。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.001.T006表6蒙兽药巴特尔-7对大鼠脏器指数的影响组别肝脏脾脏肾脏对照组3.21±0.190.33±0.060.78±0.08Baatar7-L组3.02±0.190.30±0.060.79±0.02Baatar7-M组3.13±0.240.34±0.070.80±0.05Baatar7-H组3.09±0.180.34±0.080.80±0.05%2.3.5蒙兽药巴特尔-7对大鼠病理剖检组织的影响Baatar-7给药6 w后，4个处理组大鼠剖检肉眼观察无显著性异常变化，进一步取肝、脾和肾HE染色，光镜（400倍）观察，蒙兽药巴特尔-7对大鼠病理剖检组织的影响见图1。由图1可知，各组大鼠的肝、脾、肾均未见显著异常变化。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.001.F001图1蒙兽药巴特尔-7对大鼠病理剖检组织的影响（HE，400×）3讨论急性口服毒性试验是指动物一次接受单剂量或24 h内接受多次剂量受试物，动物在短期内出现毒性反应的试验，是毒理学安全性评价试验中最基本的试验[22-23]。急性毒性试验因受Baatar-7溶液质量浓度和体积的影响，无法给予动物更大剂量的药物，无法测出半数致死量LD50[24]，按毒理学评价标准及药物毒性分级标准，LD505 000 mg/kg时，可以认为该药物实际无毒[25]。根据急性毒性试验原则[26]，对无法测出LD50的药物需进行最大耐受量试验，本试验中，小鼠给药量达到10 000 mg/kg·BW，1 w内小鼠无显著异常。可判定Baatar-7安全实际无毒。亚慢性毒性试验是评价药物或毒物亚慢性危害的主要依据，可以判断药物对靶器官和受试动物的累积作用[27]。在常见的血液生化指标中，ALT和AST是检测肝功能的重要指标，常在临床上用作肝损伤，包括氧化应激和肝脏有关疾病的评价[28]。CREA和BUN是评价肾小球滤过功能的重要指标，当肾小球滤过功能下降、肾功能失代偿时，血清CREA和BUN含量会出现异常，因此血清肌酐和尿素可以作为判断肾代谢功能的指标[29-30]。本试验中，大鼠未出现消瘦或生长缓慢等现象，表明巴特尔-7不会使大鼠的生长出现延缓现象；与对照组相比，巴特尔-7低、中、高剂量组大鼠的RBC、WBC、PLT、HGB、Lymph%、Gran%等指标均无显著差异；试验组大鼠的TP、ALT、BUN、CREA等指标均为正常，且与对照组无显著差异，表明大鼠长期灌胃蒙兽药巴特尔-7并不会影响肝肾功能；各组大鼠的脏器指数均处于正常范围之内，未有大幅度增重或减轻[31]，且给药组的脏器指数与对照组相比差异不显著。通过对肝脏、脾脏和肾脏组织切片的观察，可以发现肝脏、脾脏和肾脏均未出现病变损伤，肝脏的肝细胞未发生变性、溶解或坏死现象，中央门静脉与窦状隙无淤血和出血现象，肝小叶结构完整，肝脏未出现中毒性疾病；脾脏实质无异常变化，脾脏实质白髓、红髓及小梁、淋巴小结和静脉窦结构清晰可见；肾小球和肾小管等结构正常，未见明显异常变化；组织切片结果与生化结果一致，大鼠机体无中毒性损伤。结果表明，该复方无亚慢性毒性作用。随着我国畜牧业的不断发展，草药类饲料添加剂被广泛使用，其在提高饲料利用率的同时还能够强化营养，改善动物生产性能，从而提升经济效益。有研究表明，在肉牛日粮中添加山楂等添加剂可以促进肉牛的采食，提高瘤胃液中部分消化酶的活性，从而促进肉牛对营养物质的消化吸收，使饲养效益显著提高[32]。王飒爽等[33]研究发现，在奶牛日粮中添加发酵中药添加剂可有效提升奶牛抗热应激能力，显著降低试验奶牛乳体细胞数量。对减少奶牛隐性乳腺炎发病率、提高奶牛生产性能有较好的促进作用。仲伟光等[34]研究表明，在肉牛日粮中添加酵母等添加剂对肉牛的干物质采食量有促进作用，能够提高肉牛的免疫能力及抗氧化能力；对肉牛的肝脏功能无明显的改善功能，但也未出现副作用。刘博等[35]研究表明，日粮中添加复方中草药可以缓解肉牛的热应激反应，降低热应激期锦江黄牛的体温和呼吸频率，改善血清抗氧化能力和免疫性能。蒙药具有低残留、毒副作用小和较少产生耐药性等作用特点。但有关蒙药作为饲料添加剂的相关报道甚少，有关蒙药作为饲料添加剂用于犊牛养殖的相关报道更少，蒙药作为饲料添加剂用于犊牛腹泻病的研究有待进一步探索。4结论蒙兽药巴特尔-7对小鼠无急性毒性作用，对大鼠不产生亚慢性毒性作用。该复方安全性高，为作为饲料添加剂应用在犊牛养殖中提供参考，为提高犊牛免疫力和保障犊牛健康提供方法，为蒙药在养牛生产中的推广应用提供参考。