抗生素滥用导致的耐药性对畜牧业构成严重威胁,危及数百万的饲养动物和农业经济稳定[1-2]。2019年,浙江和福建省动物源沙门氏菌耐药水平较高,多重耐药性普遍[3],而目前耐药菌株的数量仍在继续上升[4]。导致这一现象加剧主要归因于抗生素滥用和市场上缺乏有效的抗菌药[5]。因此,寻找新的有效抗菌药迫在眉睫。在此背景下,研究发现抗菌肽(AMPs)在预防和控制多重耐药细菌感染方面具有很好的效果[6]。天然抗菌肽通常由50个以下的氨基酸组成的两亲性的短多肽,具有丰富的β结构或α螺旋。这种小分子多肽广泛存在于生物体内,作为先天免疫系统的成分之一,可以抵御其他外来物质,诱导宿主免疫系统[7]。抗菌肽对植物[8]、无脊椎动物[9]体内的先天免疫功能具有重要的作用,在具有后天免疫功能的脊椎动物体内,抗菌肽主要存在于白细胞、口腔或皮肤上皮细胞和体液中[10-12]。抗菌肽具有免疫调节和控制炎症的作用[13]。了解抗菌肽的作用机制对进一步开发治疗药物十分重要。传统研究认为,抗菌肽的作用机制主要是与细菌细胞膜相互作用。微摩尔浓度的抗菌肽即能与细胞膜成分相互作用,形成瞬态通道、胶束化、膜溶解或者在膜上的易位,从而导致细胞膜渗透性增加直至溶解[14]。越来越多的文章证明抗菌肽还存在其他更多针对性的作用机制,比如针对细菌生长代谢过程,抑制细菌蛋白质合成、抑制核酸合成、破坏酶或蛋白质活性[15]。沙门氏菌是最常见的食源性致病菌[16],可以引起人体的腹泻、菌血症等感染性疾病[3]。动物粪便污染是沙门氏菌感染的重要来源之一[17]。感染沙门氏菌的牲畜和家禽直接对市场流通的经济动物及动物源食品造成污染[18]。本研究在前人研究基础上,选取4种不同动物源抗菌肽(分别为蛇源抗菌肽C-BF、人源抗菌肽LL-37、蛙源抗菌肽Magainin以及蜂源肽Melittin),作用于2种沙门氏菌(肠炎沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌),探讨不同抗菌肽对于细菌的DNA结合活性、抑制蛋白质合成作用、细胞膜渗透作用,为针对不同细菌合理应用抗菌肽提供参考。1材料与方法1.1供试菌株猪霍乱沙门氏菌CMCC 50020与肠炎沙门氏菌CMCC 500411购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。1.2试验试剂抗菌肽C-BF、抗菌肽LL-37、抗菌肽Magainin以及抗菌肽Melittin均购自吉尔生化有限公司;PBS、Triton X-100、BCA蛋白定量试剂盒和革兰氏染色试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司;DNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司;15K DNA Maker购自北京全式金生物技术有限公司。1.3菌悬液的制备-80 ℃环境下取出菌种保藏管,按1%体积比吸取少量菌液转接至无菌的MH液体培养基中,37 ℃恒温振荡培养过夜,转速250 r/min,观察到菌液浑浊后取出培养基;重复上述步骤,对活化1次的菌液进行扩大培养。吸取菌液前,需要振荡或吹打混匀。扩大培养菌液浑浊后,混匀菌液,吸取适量菌液测量OD600 nm值,利用分光光度计调整菌液浓度直至吸光值在0.5左右。离心菌悬液,去掉上清液,加入与菌液等体积的PBS进行重悬;重复上一步骤,制备得到菌悬液。1.4抗菌肽对细菌DNA结合活性试验试验由细菌DNA提取和DNA凝胶电泳两部分组成。参照DNA提取试剂盒说明书提取菌悬液中细菌DNA,利用NanoDrop测定DNA浓度和纯度,将菌液DNA浓度调至90 mg/L。凝胶电泳样本制备体系见表1。每组2个平行,试验重复2次。用移液器吸取20 μL混合总DNA于EP管中,加入4 μL 6×上样液,确保加样量一致。混匀后小心加入样品孔,设置好电泳装置,打开开关,在120 V、80 A条件下电泳30 min,可见含溴酚蓝的蓝色条带移动。电泳结束后,小心转移凝胶至紫外成像系统中,拍照记录。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.013.T001表1凝胶电泳样本制备体系试剂A组B组C组D组对照组DNA(90 mg/ L)88888抗菌肽/ng3607201 4402 8800PBS溶液/μL加至混合体系总体积为20 μL6×上样液44444注:A、B、C、D组分别为抗菌肽与细菌DNA质量比0.5、1.0、2.0、4.0。1.5抗菌肽抑制细菌蛋白质合成试验取上述制备的菌悬液,在96孔细胞培养板中,试验组每孔加入100 μL菌悬液,对照组对应添加100 μL的PBS溶液。4种动物源抗菌肽对沙门氏菌MIC的测定结果见表2。对照孔和菌悬液孔分别添加0、1/2MIC、MIC、2×MIC浓度的抗菌肽,每组4个平行,平行独立重复3次试验。轻轻混匀后孵育0.5 h,每孔加入20 μL 0.1% Triton X-100,孵育20 min进行重悬。利用BCA法测定各组蛋白浓度,在酶标仪上测定562 nm波长处吸光值,记录数据,根据标准曲线计算总蛋白含量,最终蛋白合成量为总蛋白含量减去抗菌肽添加量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.013.T002表24种动物源抗菌肽对沙门氏菌MIC的测定结果菌种C-BFMagaininMelittinLL-37肠炎沙门氏菌8641616猪霍乱沙门氏菌8641632mg/L1.6抗菌肽对细菌形态的影响每组菌悬液加入2×MIC浓度的抗菌肽,对照组对应添加等体积PBS,在恒温箱中振荡孵育30 min,吸取少量样本于载玻片上进行革兰氏染色,在油镜下进行拍照观察。2结果与分析2.14种动物源抗菌肽与肠炎沙门氏菌的DNA结合活性(见图1)由图1可知,抗菌肽C-BF在与细菌DNA质量比为1∶1时,即可结合菌体DNA,抑制DNA迁移;在质量比为2∶1时,完全抑制。抗菌肽Melittin与LL-37在与DNA质量比为2∶1时即能够完全抑制DNA的迁移,而抗菌肽Magainin在所测质量比范围内都没有抑制DNA迁移的现象。以上结果说明,抗菌肽C-BF、Melittin、LL-37在低浓度下即可与沙门氏菌DNA结合,而抗菌肽Magainin在低浓度下不会与DNA结合。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.013.F001图14种动物源抗菌肽与肠炎沙门氏菌的DNA结合活性注:泳道从左至右为DNA Marker、对照组、细菌DNA和抗菌肽,质量比为2∶1、1∶1、1∶2、1∶4,每组2个平行。2.24种动物源抗菌肽抑制细菌蛋白质合成试验4种动物源抗菌肽对猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌的蛋白合成抑制见图2、图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.013.F002图24种动物源抗菌肽对猪霍乱沙门氏菌的蛋白合成抑制10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.013.F003图34种动物源抗菌肽对肠炎沙门氏菌的蛋白合成抑制由图2、图3可知,抗菌肽Magainin对菌体蛋白合成的抑制作用最强,抗菌肽Melittin和C-BF的蛋白抑制作用较强,抗菌肽LL-37的蛋白抑制作用最弱。以上结果表明,抗菌肽具有抑制蛋白质合成的作用,并且浓度越高,抑制效果越强。同种抗菌肽对不同菌体的蛋白合成抑制效果也不同。2.34种动物源抗菌肽对肠炎沙门氏菌形态的作用(见图4)由图4可知,革兰染色阴性。与对照组相比,经过抗菌肽处理的试验组,在1 000倍油镜下拍照成像模糊,菌体表面粗糙,出现不规则变长皱缩,细菌细胞质出现空泡,内容物外泄,视野内细菌数量明显降低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.013.F004图44种动物源抗菌肽对肠炎沙门氏菌形态的作用(1 000×)3讨论大多数的抗菌肽均能够透过细菌胞膜发挥杀菌作用,一些抗菌肽具有多种作用机制,能通过胞内靶点发挥作用[19]。正确了解这些抗菌肽的作用机制以及生物效应对药物研发十分重要。本研究中,4种抗菌肽2MIC浓度均对细菌有较好的杀灭抑制效果。张子越[20]研究发现,未受损的菌体细胞具有正常饱满的形态,细胞胞膜结构完整;经过抑菌药物处理的菌体会随着时间出现不规则变长、皱缩变圆、死亡等现象。本试验中,经过2MIC浓度抗菌肽处理后的菌体表面粗糙,观察模糊,说明抗菌肽会对细菌胞膜产生影响。杨昆等[21]发现,抗菌肽BCp12能够破坏细菌胞膜,使细胞质空化,进而导致细菌死亡。Balhara等[22]通过体外试验模型证明,抗菌肽与细菌胞膜的相互作用以及对脂质双分子层的破坏,使菌膜破裂,内容物溢出,进而导致菌体死亡,与本研究结果相似。抗菌肽的主要作用机制是提高膜渗透性和破坏膜结构[23]。抗菌肽为阳离子肽,阳离子肽与细菌表面产生静电结合,使抗菌肽被吸引到细菌表面,抗菌肽可能先被革兰氏阴性菌表面带负电荷的脂多糖(LPS)分子吸引[14]。抗菌肽与细菌外膜结合后,一部分抗菌肽通过静电结合力扩散到内膜,在内膜中达到一定浓度后,抗菌肽开始插入细胞膜,通过机械方式自组装穿过膜[24-25]。最小有效浓度的抗菌肽不能导致膜渗透,但是仍起到杀菌作用,说明抗菌肽有其他的杀菌作用机制,具有细胞内靶点[26]。如果要使细胞死亡,必须要达到一定的膜渗透强度使膜溶解。抗菌肽可能与细胞质内的某些成分(蛋白质、DNA)发生破坏作用[23]。研究人员通过蛋白质组阵列分析方法确定了一系列抗菌肽的胞内蛋白质靶点,发现4种抗菌肽具有30种共同的蛋白质靶点[27]。单种抗菌肽与多个靶点或多种抗菌肽与单个靶点具有限制细菌耐药性发展的可能性[23]。研究表明,抗菌肽BF2-A/B在翻译水平上可以抑制蛋白质的合成[28]。抗菌肽Drosocin、Pyrrhocoricin、Apidaecin能够抑制蛋白质的合成与折叠[29]。牛源的抗菌肽Bac5、Bac7可以抑制蛋白质和RNA的合成,降低ATP含量从而抑制呼吸作用,发挥杀菌作用[30]。在抗菌肽家族中,具有抗生素潜力的候选药物富含脯氨酸的抗菌肽(PrAMPs)[31]不影响细胞膜的完整性,PrAMPs通过靶内目标来杀死微生物病原体[29]。PrAMPs进入细胞质内,会通过结合核糖体来抑制蛋白质合成。抗菌肽可以与70S核糖体相互作用,抑制蛋白质合成,通过多种氢键和堆积相互作用促进相互作用[32]。本研究证明,4种抗菌肽均具有抑制蛋白质合成的作用,通过对比不同抗菌肽对沙门氏菌的作用,发现相对于抗菌肽Melittin、C-BF、抗菌肽Magainin对菌体蛋白合成的抑制作用更强,抗菌肽LL-37的蛋白抑制作用最弱。此外,在蛋白合成抑制试验中发现,随着处理时间的延长,对照组未添加菌液的抗菌肽最终含量明显低于最初含量,说明抗菌肽在膜环境中能形成更加稳定的结构[33]。抗菌肽可以结合DNA,阻止DNA复制。抗菌肽与DNA相互作用后能直接影响相关基因表达,从而抑制或破坏细菌生长代谢所需物质的合成[34]。杨昆等[21]研究表明,抗菌肽BCp12在菌体内能够竞争结合位点,通过嵌入方式结合DNA,影响DNA的生物学活性,从而抑制细菌的生长繁殖。郝刚等[28]发现,抗菌肽BF2-A/B能够明显抑制菌体的DNA合成,降低基因组DNA合成总量。裴志花[30]研究发现,抗菌肽MDAP-2能够渗透细胞膜,阻止DNA复制,但是DNA结合活性不强,表明这不是抗菌肽MDAP-2主要的杀菌机制。与上述研究结果相似,本研究中抗菌肽Magainin能够结合DNA,但是DNA结合活性弱,证明其主要的杀菌机制并非与DNA结合。在4种抗菌肽中,抗菌肽Magainin对沙门氏菌的抗菌活性最低。抗菌肽Magainin是一种膜通透肽[35],正电荷在抗菌肽与细菌胞膜之间的相互作用中极其重要,抗菌肽的阳离子性影响抗菌活性,但是两者之间不是线性关系[36]。因此,推测抗菌肽Magainin对沙门氏菌的抗菌活性较低可能因为其净电荷数较低[37],其作用机制有更深入的研究。有研究指出,相同的抗菌肽在不同的生物体中作用方式有所不同[19]。4结论本研究对比4种不同动物源抗菌肽杀菌机制。4种抗菌肽在一定浓度下均能通过破坏细胞膜对沙门氏菌起杀菌作用,并且一定程度上抑制细菌DNA和蛋白质合成。

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