限制性氨基酸（limiting amino acids，LAA）是限制反刍动物对饲粮氮的利用和生产性能以及遗传潜力发挥的重要因素[1-2]。瘤胃微生物能够利用饲粮含氮物质合成微生物蛋白，为小肠提供组成相对恒定的必需氨基酸，但育肥羊仍然存在LAA。有研究表明，蛋氨酸、赖氨酸和苏氨酸是育肥羊的LAA，不同饲粮条件下，各种LAA的相对限制程度不同[3]。有研究表明，利用尿素提供氮源的育肥羊和饲喂玉米豆粕型饲粮的山羊第一和第二限制性氨基酸分别为蛋氨酸和赖氨酸[4-5]。饲喂低过瘤胃蛋白质饲粮的羔羊以及饲喂玉米型饲粮的生长绵羊，蛋氨酸和苏氨酸是其第一和第二限制性氨基酸[3,6]。在育肥羊生产中，通过改变饲粮营养水平及饲喂模式来调控小肠可吸收LAA的平衡，可以最大限度地提高机体对饲粮氮的利用效率[7-9]。本实验室前期研究发现，饲喂颗粒全混合日粮或粉状全混合日粮对育肥羊十二指肠氨基酸组成和含量无显著影响，在其基础上补饲苜蓿干草可以改善瘤胃发酵，提高十二指肠必需氨基酸的含量及比例，其中颗粒全混合日粮补饲苜蓿干草较其他饲喂模式能显著提高育肥羊的ADG[10]。但是，该饲喂条件下蛋氨酸和苏氨酸含量与预测的氨基酸需要量[11]相比偏低，其供应量无法满足机体的需要量，这些氨基酸可能是该饲粮条件下育肥羊体内蛋白质合成的LAA。因此，本试验采用氨基酸剔除法研究4种不同氨基酸灌注液对育肥羊氮代谢的影响，以确定育肥羊在颗粒全混合日粮补饲干草饲喂下LAA的种类和顺序，以期为全混合日粮配制中过瘤胃氨基酸的使用提供参考。1材料与方法1.1试验动物选取4只健康、体重（44.85±2.70）kg的安装永久性十二指肠瘘管的哈萨克公羊，代谢笼内单笼饲养。整个试验期内育肥羊每天饲喂1 000 g的PTMR和200 g苜蓿干草，8：00、20：00等量饲喂1次，自由饮水。1.2试验设计参照NRC（2007）育肥羊营养需要配制全混合日粮[11]，将精粗原料混合粉碎制成颗粒，苜蓿干草铡短饲喂，基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.001.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）原料组成/%PTMR营养水平PTMR苜蓿干草合计100.00玉米30.00消化能/(MJ/kg)11.468.60甜菜颗粒粕8.00粗蛋白质/%13.2515.93棉籽13.00中性洗涤纤维/%34.7354.77玉米酒糟6.00酸性洗涤纤维/%9.4529.76玉米胚芽粕12.00钙/%1.481.37葵花籽壳11.00磷/%0.720.91玉米皮15.00蛋氨酸/%0.350.21石粉2.30苏氨酸/%0.190.18食盐1.00异亮氨酸/%0.370.32小苏打1.00亮氨酸/%0.520.29酶制剂0.10赖氨酸/%0.310.35酵母培养物0.30苯丙氨酸/%0.600.46预混料0.30缬氨酸/%0.430.32精氨酸/%0.720.33组氨酸/%0.570.49甘氨酸/%0.280.21谷氨酸/%0.790.34丙氨酸/%0.360.22天冬氨酸/%0.941.50脯氨酸/%0.981.24丝氨酸/%0.440.40酪氨酸/%0.510.33必需氨基酸/%4.062.95非必需氨基酸/%4.304.24总氨基酸/%8.367.19注：1.预混料为每千克日粮提供：Zn 50 mg、Fe 80 mg、Mn 40 mg、Cu 19 mg、Co 0.25 mg、I 0.8 mg、Se 0.30 mg、VA 10 000 IU、VD 3 300 IU、VE 200 IU。2.营养水平均为计算值。试验采用4×4拉丁方试验设计，试验分4期，每期7 d，前5 d为预试期，后2 d为正式采样期。每期试验连续灌注500 mL/d的4种氨基酸溶液，分别是无氨基酸的对照组（CON）、含8种必需氨基酸的全灌组（8EAA）、8种必需氨基酸剔除蛋氨酸组（-Met）、8种必需氨基酸剔除苏氨酸组（-Thr）。根据平均日增重290 g[10]以及育肥羊自身蛋白质的氨基酸组成计算代谢氨基酸的需要量[12]，参照本实验室前期研究得出的哈萨克羊小肠氨基酸消化率[13]及本试验饲粮下十二指肠氨基酸流量计算小肠净吸收氨基酸量。灌注剂量由代谢氨基酸需要量减去小肠净吸收氨基酸量来计算。为减少氨基酸之间的共限制性作用[14]，采用氨基酸剔除法从十二指肠瘘管进行灌注。全部试验组（除对照组外）均提供谷氨酸和甘氨酸，避免灌注的必需氨基酸参与其他氨基酸的合成，以及保证试验组（除对照组外）等氮。为避免氨基酸用作糖异生以及能量不足制约哈萨克羊对灌注氨基酸的吸收，全部试验羊灌注葡萄糖73 g/d[6]。参考张帆等[15]的试验方法进行氨基酸灌注液的配制及灌注。十二指肠氨基酸灌注溶液组成见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.001.T002表2十二指肠氨基酸灌注溶液组成项目对照组8EAA组-Met组-Thr组L-蛋氨酸（L-Met）—1.96—1.96L-苏氨酸（L-Thr）—5.755.75—L-异亮氨酸（L-Ile）—2.442.442.44L-亮氨酸（L-Leu）—7.457.457.45L-赖氨酸（L-Lys）—5.635.635.63L-苯丙氨酸（L-Phe）—1.771.771.77L-缬氨酸（L-Val）—3.893.893.89L-精氨酸（L-Arg）—4.024.024.02甘氨酸（Gly）—10.9310.9310.93L-谷氨酸（L-Glu）—13.1815.1220.29葡萄糖（Glucose）73.0073.0073.0073.00总氮量（TN）08.158.158.15g/d1.3样品采集与处理试验期每天早上饲喂前检查是否有余料，如有余料准确称量后记录保存。每期第6~7 d，采集总排粪量和排尿量，取200 g粪样和有代表性的尿样（2%尿量）冷冻保存，测定常规养分含量。每期第7 d的23：00，颈静脉采血，离心，测定血清尿素氮（BUN）的含量。1.4测定指标及方法每期试验的预试期第1 d，晨饲前空腹称重，正试期结束后，8：00饲喂前称量，记录羊的末重。饲料、粪、尿含氮量按凯氏定氮的方法进行测定；参照翟少伟[16]建立的方法测定BUN浓度。平均日采食量=每日饲喂量-每日余料量 (1)平均日增重=(每期末重-每期初重)/每期试验天数 (2)料重比=每期平均日采食量/每期平均日增重 (3)总摄入氮=饲粮采食氮+灌注氮 (4)氮沉积=总摄入氮-粪氮-尿氮 (5)1.5数据统计与分析试验数据使用SAS 9.2软件进行协方差分析，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1十二指肠灌注剔除Met和Thr的氨基酸溶液对育肥羊生长性能的影响（见表3）由表3可知，8EAA组育肥羊平均日增重和料重比较对照组差异显著（P0.05）。与8EAA组相比，-Met组育肥羊平均日增重显著降低，料重比显著升高（P0.05）；-Thr组育肥羊平均日增重降低，料重比升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.001.T003表3十二指肠灌注剔除Met和Thr的氨基酸溶液对育肥羊生长性能的影响项目对照组8EAA组-Met组-Thr组初重/kg50.2850.1550.4050.02末重/kg52.3152.7352.7552.45平均日采食量/(g/d)925.32960.28923.11935.34平均日增重/(g/d)290.31b368.15a*335.59b*347.92a*料重比3.19a2.61b*2.75a*2.69b*注：同行数据肩标*表示与对照组差异显著（P0.05），无*表示与对照组差异不显著（P0.05）；不同字母表示与8EAA组差异显著（P0.05），字母相同或无字母表示与8EAA组差异不显著（P0.05）；下表同。2.2十二指肠灌注剔除Met和Thr的氨基酸溶液对育肥羊氮代谢和血清尿素氮的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，8EAA组育肥羊总摄入氮、尿氮、表观消化氮和氮沉积显著升高(P0.05)。与8EAA组相比，-Met组育肥羊尿氮排出量显著升高(P0.05)，氮沉积量显著降低(P0.05)。与8EAA组相比，-Thr组育肥羊尿氮排出量提高(P0.05)，氮沉积量降低(P0.05)。与对照组相比，十二指肠灌注氨基酸溶液使育肥羊血清尿素氮的含量显著升高(P0.05)。与8EAA组相比，-Met组和-Thr组血清尿素氮的含量有升高趋势，其中-Met组达到显著水平(P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.001.T004表4十二指肠灌注剔除Met和Thr的氨基酸溶液对育肥羊氮代谢和血清尿素氮的影响项目对照组8EAA组-Met组-Thr组饲粮采食氮/(g/d)17.8118.7717.7718.22灌注氮/(g/d)0.008.158.158.15总摄入氮/(g/d)17.81b26.91a*25.91a*26.36a*粪氮/(g/d)4.464.604.554.59尿氮/(g/d)3.41b5.77a*7.50b*6.56a*表观消化氮/(g/d)13.35b22.31a*21.36a*21.77a*氮表观消化率/%74.94b82.90a*82.43a*82.59a*氮沉积/(g/d)10.07b16.55a*13.86b*15.22a*沉积氮/总摄入氮/%56.54b61.50a*53.50b57.73b沉积氮/表观消化氮/%74.42a74.18a64.88b*69.91b*尿素氮/(mmol/L)4.16b5.43a*6.23b*5.97a*3讨论3.1十二指肠灌注剔除Met和Thr的氨基酸溶液对育肥羊生长性能的影响反刍动物小肠氨基酸供应不平衡，机体不能利用足够的营养物质会导致生长性能降低[17]。本试验结果显示，与对照组相比，十二指肠灌注8EAA溶液能够显著提高育肥羊平均日增重，降低料重比。张帆等[15]发现，与无氨基酸灌注组相比，十二指肠灌注8EAA组溶液可以使育肥羊平均日增重增加24.68 g，与本试验研究结果一致。结果表明，十二指肠灌注氨基酸可以提高小肠可吸收氨基酸数量，降低因限制性氨基酸缺乏对其他氨基酸吸收效率的影响[18]，提高氨基酸的利用率，从而提高动物的生长性能。本试验结果表明，从8EAA溶液中剔除Met和Thr时，育肥羊平均日增重分别下降32.56和20.23 g，料重比分别升高0.14和0.08。李雪玲等[19]发现，开食料中扣除30%的Met可以显著降低断奶羔羊的平均日增重和料重比。周玉香等[20]和向白菊等[21]研究发现，饲料中添加过瘤胃Met可以显著提高反刍动物平均日增重。王洪荣等[3]研究发现，与全量灌注组相比，十二指肠灌注剔除Met和剔除Thr组氨基酸溶液的生长绵羊平均日增重分别下降53.17%和36.82%。上述研究结果与本试验一致，可能因为灌注液中Met和Thr的扣除会引起小肠内可吸收氨基酸模式不平衡，从而抑制育肥羊的生长发育。3.2十二指肠灌注剔除Met和Thr的氨基酸溶液对育肥羊氮代谢和血清尿素氮的影响本试验研究发现，与对照组相比，氨基酸灌注组育肥羊的总摄入氮量显著提高，粪氮无显著变化，说明灌注液中的氨基酸可能全部被小肠吸收；8EAA组育肥羊对氮的利用率明显提高。张帆等[15]研究发现，与无氨基酸灌注组相比，十二指肠灌注含有8种必需氨基酸的溶液组可以显著提高育肥羊体内氮的沉积率。Haque等[22]研究表明，饲喂奶牛氨基酸相对平衡的饲粮，可以提高相同粗蛋白质水平下奶牛的乳蛋白含量和饲粮氮的利用效率，与上述研究结果一致。可能是因为进入小肠的可代谢氨基酸数量不足以支持哈萨克羊氮沉积需要量[12]；8EAA组中灌注的氨基酸比例均衡，与对照组相比更匹配育肥羊的需要量；十二指肠灌注液中的氨基酸较饲料蛋白质中的氨基酸更容易吸收。机体对饲粮蛋白质的利用效率不仅取决于氨基酸供应的数量，还受其比例模式的影响[22-23]。本试验结果表明，从8种EAA溶液中分别剔除Met和Thr时，机体尿氮排出量增多，总摄入氮和氮沉积下降，并且剔除Met组下降幅度高于剔除Thr组，表明育肥羊在颗粒全混合日粮饲喂条件下，Met和Thr的供应不足可能会限制氮的沉积，并且Met限制性程度要高于Thr。有研究表明，Met和Thr是羊的第一和第二限制性氨基酸，Met和Thr的缺乏或增加会改变机体对氮的沉积效率[3,6]，与本试验研究结果一致。也有研究表明，Lys和Met是以玉米-豆粕型饲粮饲喂条件下反刍动物的第一和第二限制性氨基酸[24-25]，与本试验研究结果不同，可能是试验动物品种及饲粮类型不同引起的。BUN是氨基酸在动物体内降解的产物，可以作为评定动物LAA的间接指标[26-27]。当饲粮氨基酸利用率降低时，BUN含量增加，机体吸收的氨基酸比例模式较平衡时，BUN含量下降[28]。本试验发现，与对照组相比，8EAA组育肥羊BUN含量显著提高，表明机体某些氨基酸的供应量超过机体的需要量，灌注的氨基酸部分被机体通过转氨基和脱氨基作用形成尿素。与8EAA组相比，剔除Met组和剔除Thr组育肥羊BUN含量分别提高0.80、0.54 mmol/L，说明Met和Thr供给量的不足会引起某些氨基酸的降解使BUN含量升高。张帆等[15]和董晓玲等[7]发现，灌注不平衡氨基酸溶液会引起机体的BUN含量显著上升。上述研究结果与本试验一致，说明Met和Thr的缺乏会导致机体可代谢氨基酸比例不平衡，降低了氨基酸用于合成蛋白质的效率，进一步引起氮沉积和ADG的下降。4结论颗粒全混合日粮补饲干草饲喂下，十二指肠灌注剔除Met和Thr的氨基酸溶液后，育肥羊平均日增重分别下降32.56 g和20.23 g，氮沉积分别降低2.69 g/d和1.33 g/d，BUN的浓度分别提高0.80 mmol/L和0.54 mmol/L。试验结果表明，该饲粮Met和Thr供应量不足，Met和Thr可能是哈萨克育肥羊的第一和第二限制性氨基酸。