家禽从蛋中孵化破壳而出的时间不同。如鸡幼雏孵化出壳时间大约为36~48 h，将鸡雏运输到饲养场也需要一定时间，这会造成鸡雏禁食和禁水长达48~72 h。在此期间，家禽只能依靠体内残留的卵黄囊作为机体维持和生长需要的营养物质来源[1-2]，而残留在体内的卵黄囊并不能满足刚出壳幼雏的维持和生长需要，会导致胸肌发生分解代谢。胚胎后期，家禽胚胎会通过口腔大量吞食羊水，可以在胚胎后期向胚蛋的羊膜腔中补充外源性营养物质，为胚胎提供必要的营养物质（胚蛋给养）[3]。有研究表明，胚蛋给养营养物质包括碳水化合物、氨基酸、蛋白质、矿物质和一些生物活性物质[4-7]。有关胚蛋给养的大部分试验研究中，碳水化合物可以直接作为能量来源被胚胎利用，减少胸肌分解代谢为糖异生提供氨基酸；蛋氨酸（Met）能够通过调节胸肌发育相关基因表达促进胸肌发育[8]。因此，本试验通过研究胚蛋给养二糖（DS）和Met对胸肌发育的影响，探索胚蛋给养在鹅上的应用效果和可行性，为鹅早期营养研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验所用吉林白鹅种蛋购自吉林省梅河口市德坤禽类食品有限公司。胚蛋给养所需DL-Met购自上海诺伟司饲料添加剂有限公司，纯度≥99%；蔗糖和麦芽糖购自上海生工生物工程有限公司，其纯度均为分析纯。孵化器为德州科裕CFZ微电脑全自动孵化机。1.2试验方法1.2.1试验设计通过照蛋选择胚胎发育良好、孵化第23 d（E23）的吉林白鹅胚蛋600枚，分为4组，每组3个重复，每个重复50枚种蛋。种蛋孵化第24 d（E24）进行胚蛋给养。对照组（CON）不进行给养。各处理组给养营养液如下：DS组营养液为25 g/L麦芽糖、25 g/L蔗糖、7.5 g/L NaCl；Met组营养液为Met 5 g/L、NaCl 7.5 g/L；复合组（DS+Met）的营养液为25 g/L麦芽糖、25 g/L蔗糖、5 g/L Met、7.5 g/L NaCl。孵化出雏后，根据体重每个处理随机分为3个重复进行饲养，保证每个重复的平均体重基本一致。饲养期28 d。1.2.2种蛋选择与孵化选择具有相近的产蛋史、产次和摄入营养物质的吉林白鹅生产合格种蛋，共计1 000枚，种蛋存放时间均不超过7 d。鹅种蛋采用全进全出制的变温孵化。在种蛋孵化的第29 d时，将胚蛋转移至出雏机。种蛋的孵化管理按常规程序进行孵化。1.2.3胚蛋给养给养液和石蜡经高压锅灭菌121 ℃处理15 min。胚蛋给养参照董信阳[9]的方法。1.2.4饲养管理出雏时记录出壳时间、出雏率、雏鹅重、第1 w的死亡率。雏鹅日粮配制参照NRC（1994）配置日粮，基础日粮组成及营养水平见表1。雏鹅分为3个重复饲养，每个重复30只，雏鹅出壳后12 h内开水，24 h内开食，提供充足的光照。雏鹅的饲养管理按正常的程序进行。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.001.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米60.00代谢能/(MJ/kg)11.67豆粕29.11粗蛋白/%19.78小麦麸6.00蛋氨酸/%0.50鱼粉2.00总含硫氨基酸/%0.77赖氨酸0.20赖氨酸/%1.08蛋氨酸0.23钙/%0.78磷酸氢钙0.84有效磷/%0.40石粉0.82粗纤维/%0.31氯化钠0.30中性洗涤纤维/%1.09多维0.30酸性洗涤纤维/%0.35微量元素0.20注：1.多维和微量元素为每千克日粮提供：VD3 200 IU、VA 1 500 mg、VE 12.5 mg、VK3 1.5 mg、VB1 2.2 mg、VB2 5.0 mg、烟酸 65 mg、叶酸1 mg、泛酸 15 mg、VB6 2 mg、生物素0.2 mg、胆碱 1 000 mg、Fe 90 mg、Cu 6 mg、Mn 85 mg、Zn 85 mg、I 0.42 mg、Se 0.3 mg、Co 2.5 mg。2.营养水平中蛋氨酸为实测值，其余均为计算值。1.3样品采集与保存于孵化的E23、E27、出壳当天（0 d：出壳后2 h内）、1日龄（1 d：出壳后24 h）、4日龄（4 d）、7日龄（7 d）、14日龄（14 d）、21日龄（21 d）和28日龄（28 d）进行样品采集，在每个时间点选取胚蛋重或体重相近的胚蛋或健康鹅雏各6枚/羽。通过照蛋选取胚胎发育正常的胚蛋，在取样之前，用手术剪打开胚蛋钝端，将鹅胚取出，鹅胚或雏鹅称重记录。1.3.1血清样品从心脏取血液样品，离心管静置5 min，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，吸出上层浅黄色血清样品，-80 ℃低温冰箱中保存待测。1.3.2胸肌组织样品快速剥离两侧胸肌，其中右侧快速称重后放入4%的福尔马林固定，以备形态学分析；左侧胸肌分离后取3份样品速冻与液氮中，于-80 ℃超低温冰箱中保存，待测。1.3.3肝脏组织样品肝脏完整取出，分别利用预冷生理盐水小心冲洗并去除肝脏上附属组织，吸干称重；取肝脏组织样品3份放入液氮中速冻，置于-80 ℃低温冰箱中保存，用于肝糖原的测定。1.4测定指标及方法1.4.1胸肌指标胸肌纤维的测定主要包括3个部分：石蜡切片的制作、HE染色和纤维直径的测定。器官指数=器官重/体重×100% (1)1.4.2血糖和糖原血清中葡萄糖和糖原含量的测定按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行。1.4.3胸肌发育基因相对表达量采用TRIzol法提取胸肌组织样中的总RNA，采用核酸蛋白仪检测总RNA浓度和纯度，将提取的总RNA反转录合成cDNA，保存在-80 ℃冰箱，备用。根据NCBI上提供的鹅β-Actin、Myf5和MSTN基因序列，在电脑上使用Primer 6.0软件设计目的基因的引物，再使用Oligo 7.0软件进行评价。β-Actin、Myf5和MSTN基因引物信息见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.001.T002表2β-Actin、Myf5和MSTN基因引物信息基因名称登录号引物序列（5'→3'）产物大小/bpβ-ActinM26111F：GCCCAGCACGATGAAGAT158R：ATTTACGGTGGACGATGGACMSTNAY448009F：GTGGCTCTTGATGACGGTAGT133R：GCAGTGTGCTGAGGATTTGAMyf5KU744843F：GCGTTTGAGACCCTGAAGAG147R：TCCCGGCAGGTGATAGTAGT以β-actin为内参基因，采用2-∆∆Ct法计算目的基因的相对表达量，其中各目的基因在胸肌样品中的ΔΔCt均以该基因孵化E23胸肌的ΔCt作为的对照。ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因 (2)ΔΔCt=ΔCt待测测样-ΔCt对照 (3)1.4.4肝脏葡萄糖-6-磷酸酶活性根据Minassian等[10]介绍方法，具体操作参照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行。葡萄糖-6-磷酸酶活性单位定义为：在37 ℃条件下每分钟每毫克蛋白所释放的微摩尔无机磷。1.5数据统计与分析试验数据使用Excel 2016整理，采用SPSS 22.0统计软件中的一般线性模型（GLM）程序对数据进行2×2方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1胚蛋给养DS与Met对鹅胚胎后期和雏鹅胸肌指数的影响（见表3）由表3可知，在E27、0 d和1 d，与CON组相比，胚蛋给养组胸肌指数显著升高（P0.05）。在4 d，胚蛋给养DS+Met组胸肌指数显著高于其他3组（P0.05）；在7 d，DS+Met组的胸肌指数显著高于CON组和DS组（P0.05）。出壳当天，DS和Met对雏鹅胸肌指数的交互作用有提高的趋势（P=0.059），在其他各时间点均无显著交互作用（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.001.T003表3胚蛋给养DS与Met对鹅胚胎后期和雏鹅胸肌指数的影响（n=3）项目CON组DS组Met组DS+Met组E231.74±0.04E271.22±0.08b1.55±0.22a1.59±0.17a1.69±0.22a0 d0.67±0.05c0.91±0.13b0.92±0.08ab1.03±0.06a1 d0.74±0.07c0.94±0.07b0.88±0.09b1.09±0.06a4 d0.64±0.07b0.65±0.04b0.72±0.09b0.82±0.07a7 d0.70±0.02b0.71±0.06b0.74±0.09ab0.79±0.07a14 d0.94±0.160.92±0.100.92±0.050.94±0.0421 d0.83±0.060.84±0.070.86±0.040.88±0.0428 d1.31±0.131.22±0.161.34±0.331.23±0.22注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。%2.2胚蛋给养DS和Met对鹅胚胎后期和雏鹅糖代谢的影响（见表4~表6）由表4可知，从E27到1 d，胚蛋给养DS+Met组和DS组雏鹅肌糖原的含量显著高于CON组和Met组（P0.05）；在4 d和7 d，DS+Met组和DS组雏鹅肌糖原的含量显著高于CON组（P0.05）。DS和Met对雏鹅肌糖原的含量在各时间点均无显著交互作用（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.001.T004表4胚蛋给养DS与Met对鹅胚胎后期和雏鹅肌糖原的影响项目CON组DS组Met组DS+Met组E233.79±0.41E273.67±0.33b5.34±0.44a3.73±0.23b5.31±0.11a0 d1.73±0.17b1.95±0.09a1.73±0.24b2.12±0.17a1 d2.04±0.22b2.45±0.21a2.01±0.32b2.39±0.32a4 d2.91±0.14c3.41±0.36ab3.09±0.32bc3.68±0.27a7 d2.00±0.10b2.40±0.20a2.14±0.29ba2.54±0.17a14 d1.66±0.281.87±0.261.70±0.311.78±0.2221 d1.57±0.181.66±0.201.60±0.321.69±0.1928 d1.53±0.141.53±0.091.61±0.161.55±0.22mg/g由表5可知，在E27、0 d和4 d，胚蛋给养DS组和DS+Met组雏鹅肝糖原的含量显著高于CON组和Met组（P0.05）；在1 d，DS组雏鹅肝糖原的含量显著高于其他3组（P0.05）。主效应分析表明，从E27到4 d，DS显著增加雏鹅肝糖原的含量（P0.05）；Met有增高1 d雏鹅肝糖原的含量的趋势（P=0.067），同时DS和Met对雏鹅肝糖原的交互作用有提高的趋势（P=0.052），而在其他各时间点均无显著交互作用（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.001.T005表5胚蛋给养DS与Met对鹅胚胎后期和雏鹅肝糖原的影响项目CON组DS组Met组DS+Met组E237.06±0.86E276.80±0.43c8.79±0.73b6.40±0.61c9.68±0.78a0 d3.31±0.29b4.08±0.17a3.48±0.51b4.21±0.53a1 d9.78±0.60b11.59±1.04a9.82±0.78b10.13±1.06b4 d32.47±1.45b39.54±3.39a32.17±1.58b38.08±3.42a7 d64.58±4.4863.96±2.0066.20±4.4265.34±2.0314 d43.69±2.3645.21±4.0645.11±2.1343.46±3.5921 d46.36±4.3443.48±3.9545.24±3.8643.55±1.5528 d43.77±4.1045.68±3.1246.16±4.0042.15±3.06mg/g由表6可知，胚蛋给养各组肝脏葡萄糖-6-磷酸酶活性显著低于CON组（P0.05），其中DS+Met组活性最低。主效应分析表明，在各时间点，DS和Met均无显著的交互作用（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.001.T006表6胚蛋给养DS和Met对雏鹅肝脏葡萄糖-6-磷酸酶的影响 单位：μmoL/（min·mg protein）项目CON组DS组Met组DS+Met组0 d0.167±0.014a0.137±0.014bc0.151±0.017b0.134±0.007c7 d0.029±0.0030.029±0.0040.027±0.0070.030±0.00728 d0.031±0.0130.030±0.0080.028±0.0110.032±0.0142.3胚蛋给养DS和Met对雏鹅胸肌纤维直径的影响（见表7）由表7可知，在出壳当天，胚蛋给养DS组和DS+Met组雏鹅胸肌纤维直径显著高于CON组和Met组（P0.05），同时Met组雏鹅胸肌纤维直径也显著高于CON组（P0.05）；在7 d，胚蛋给养Met组和DS+Met组雏鹅胸肌纤维直径显著高于CON组和DS组（P0.05）。主效应分析表明，在出壳当天，DS和Met对雏鹅胸肌纤维直径的增加有显著交互作用（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.001.T007表7胚蛋给养DS和Met对雏鹅胸肌纤维直径的影响项目CON组DS组Met组DS+Met组0 d5.31±0.09c6.37±0.36a5.88±0.36b6.24±0.26a7 d7.02±0.32c7.02±0.32c7.63±0.84ab7.96±0.34a28 d12.55±1.3412.43±0.4912.93±1.0712.51±1.04μm2.4胚蛋给养DS和Met对雏鹅胸肌发育基因相对表达量的影响（见表8）由表8可知，在0 d、7 d和28 d，与CON组和DS组相比，胚蛋给养Met组和DS+Met组雏鹅胸肌Myf5 mRNA的相对表达量显著升高，MSTN mRNA相对表达量显著降低（P0.05）。主效应分析表明，在出壳当天，DS和Met对雏鹅胸肌MSTN mRNA相对表达量的交互作用有降低的趋势（P=0.066）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.001.T008表8胚蛋给养DS与Met对雏鹅胸肌Myf5和MSTN mRNA相对表达量的影响项目CON组DS组Met组DS+Met组Myf50 d1.00±0.19b1.19±0.17b1.50±0.17a1.61±0.16a7 d2.53±0.27b2.55±0.32b3.08±0.24a3.03±0.55a28 d4.61±0.33b4.58±0.73b5.87±0.86a5.62±0.64aMSTN0 d1.00±0.22a1.11±0.16a0.73±0.08b0.64±0.07b7 d4.40±0.62a4.39±1.17a3.12±0.63b2.92±0.37b28 d1.36±0.17a1.40±0.20a0.83±0.11b0.77±0.10b3讨论3.1胚蛋给养DS对胚胎后期和雏鹅胸肌发育的影响胚胎后期和出壳早期，为满足出雏和小肠等器官的快速发育，需要大量的营养物质，特别是能量。在胚胎后期机体的糖原动员为出雏等活动和器官的发育提供能量，胚胎后期胚胎的糖原大量动员与肝脏和骨骼肌中，能量在机体处于紧缺状态，注射DS可以缓解肉鸭出壳时能量缺少的现象[5]。本试验研究表明，胚蛋给养DS可以提高E27到1 d的胸肌相对重和出壳当天的肝脏重，提高出壳前后肌糖原和肝糖原的含量，与董信阳对鸽的研究结果相似[9]。外源性碳水化合物可以促进糖原的合成，通过提高糖原合成酶mRNA的转录效率[11]，给养胚蛋DS直接提供能量，可以节约部分肝糖原和肌糖原的动员。本试验中，给养DS显著降低肝脏葡萄糖-6-磷酸酶的活性，这与鸭[5]和鼠[10]上的研究结果一致。提高肝脏中糖原浓度的原因可能是能量直接来源于DS所提供的葡萄糖，不是通过加快内源糖异生提高糖原浓度。这表明胚蛋给养DS可以缓解机体出壳时的能量缺少的现象。本试验中，胚胎注射DS还可以提高出壳当天的胸肌纤维直径和Myf5 mRNA的相对表达量。有研究表明，胚蛋给养DS可以提高3 d肉鸭胸肌纤维素的横截面积，与本试验的结果相似[5]。证明胚蛋给养DS可通过供能间接的缓解胸肌的降解来提供糖异生底物，从而影响胸肌发育。3.2胚蛋给养Met对胚胎后期和雏鹅胸肌发育的影响胚胎期和出壳早期骨骼肌的降解可能会导致出壳后骨骼肌生长延缓[5]。胚胎后期机体活动加强，出壳过程和相关组织的生长均需要消耗大量的能量，而胚蛋中所能供给的糖类物质远远不能满足幼雏在出壳早期时的能量需求，胸肌作为糖酵解型肌肉容易动员为糖异生和组织的生长提供氨基酸底物。本试验研究表明，胚蛋给养Met能够提高雏鹅E27到7 d胸肌相对重，提高雏鹅出壳当天和7 d胸肌纤维直径，提高Myf5 mRNA的相对表达量，降低MSTN mRNA的相对表达量。Myf5是成肌调节因子家族4个成员中最先表达的基因，在控制细胞周期方面具有独特的作用，可以激活肌肉卫星细胞[12]。因此，Met可能促进Myf5的表达来激活胸肌卫星细胞，分化出更多肌纤维提高胸肌产量。MSTN是肌肉发育的负调控因子，其表达量与甲基化水平呈负相关[13]。研究发现，提高肉鸡日粮的Met水平能够增加骨骼肌中MSTN基因的甲基化水平[14]。Met对MSTN基因的调控作用可能是通过miRNA的表达来实现的，某些必需氨基酸（包含Met）能够使人类骨骼肌的某些miRNA表达量上升，将MSTN基因表达量下调[15]。Met能够通过提高Myf5 mRNA的相对表达量，降低MSTN基因甲基化水平来降低MSTN mRNA的相对表达量来促进低初生重肉鸡胸肌的发育[8]。因此，胚蛋给养Met可通过调节Myf5和MSTN mRNA的相对表达量促进胸肌的发育。3.3胚蛋给养DS和Met对胚胎后期和雏鹅胸肌发育的交互影响本试验研究发现，胚蛋给养DS和Met对出壳当天胸肌相对重的提高有交互作用的趋势，对E27胸肌肝糖原含量的提高有交互作用；对出壳当天胸肌纤维直径的增加和MSTN mRNA的相对表达量的降低也存在交互作用。这与许多的胚蛋给养研究的结果相似[4-5,16-18]。胚蛋给养对动物在出壳前后的效果较好，但未能持续地影响到上市或体成熟时期。本试验中，DS和Met的交互作用主要表现在胚胎后期到出壳1 d，可能因为在出壳前后机体处于能量紧缺时期，通过DS的添加主要目的是为机体提供能量，缓解胸肌动员。但DS的注射剂量和浓度均会影响其效果的发挥。当剂量过大会直接影响孵化时间。胚蛋给养延长了孵化时间；提高注射的浓度的同时也会提高注射液的渗透压，渗透压会影响家禽的孵化率[16]。研究4个浓度（蔗糖和麦芽糖分别为15、25、35和45 g/L）的DS注射液对鸽的影响时发现，蔗糖和麦芽糖的浓度为25 g/L时各项指标较优[9]。因此，受到注射剂量和浓度的影响，DS的供能是有限的，主要在出壳前后起作用；Met可以促进胸肌发育，但在出壳前后是机体能量代谢和生存环境发生改变的时期，在出壳后家禽会受到饲粮和外界环境的影响，所以均未能发挥长时间的效应。所以DS主要在出壳前后通过提高肌糖原和肝糖原的含量来缓解胸肌的降解，Met主要在出壳前后通过调节肌肉发育相关基因来促进胸肌的发育。因此，二者交互作用主要体现在出壳前后，未能对后续生长起到直接的作用。4结论胚蛋给养DS可以通过提高机体的糖原储备来缓解胸肌的蛋白质动员；胚蛋给养Met可以通过调节Myf5和MSTN mRNA的相对表达量来促进胸肌的发育，二者在出雏前后对缓解机体能量紧缺状态和促进胸肌发育有一定的交互作用。