厨余成分复杂、营养丰富、易腐败变质、易滋长寄生虫、卵及病原微生物，会导致疾病传播[1-2]。目前，我国厨余用作饲料主要有2种方式：直接将厨余经过脱水、烘干、灭菌处理得到泔水粉，但存在蛋白质同源的安全问题；通过菌株生物发酵，将厨余中的有机物质转化为单细胞蛋白饲料，发酵饲料中含有大量的氨基酸、糖、维生素及多种生物活性酶，利于动物对饲料的消化吸收[3-5]。淀粉酶是一类可以催化淀粉水解酶的总称，按水解淀粉方式可以将淀粉酶分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶4类。饲料中添加淀粉酶可以提高饲料利用率，促进动物生长，减少粪便等污物的排放，改善养殖环境，提高动物机体免疫[6]。厨余富含淀粉、纤维素、蛋白质、脂类等有机营养物质。厨余水分为14%时，粗蛋白含量18%~21%、粗脂肪含量19%~24%、总糖约30%~40%，是1种很有潜力的饲料[7-8]。饲料化是厨余循环利用的一种生态环保型方式。随着国内对餐厨废弃物综合利用的开发，厨余在发酵饲料方面的应用越来越受重视。因此，筛选出能够对厨余高效降解的微生物菌株是厨余饲料化的技术基础和关键。本研究从厨余中分离多株芽孢杆菌，通过对菌株培养特征、生化测定及16S rRNA序列分析，进行分类学鉴定；通过菌株对淀粉降解能力、酶活及酶学性质的测定，旨在筛选出高产淀粉酶的芽孢杆菌菌株，以期为厨余中淀粉的生物利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料厨余取自徐州生物工程职业技术学院食堂。芽孢杆菌养基和HBI芽孢杆菌生化鉴定条购自青岛生物；Taq DNA polymerase、Vic Gel Red核酸染料、DNA快速抽提试剂盒、DL1000和DL2000 Marker购自生工生物工程（上海）股份有限公司；琼脂糖G-10购自西班牙BIOWEST；可溶性淀粉、蛋白胨、卢戈氏碘液购自扬州博瑞生物工程有限公司；3，5-二硝基水杨酸、葡萄糖、麦芽糖、氢氧化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸等试剂均为国产分析纯；722分光光度计购自北京世纪科信科学仪器有限公司。富集培养基：蛋白胨5 g/L、可溶性淀粉10 g/L、牛肉膏2 g/L、葡萄糖5 g/L、NaCl 5 g/L，pH值7.0~7.2。淀粉琼脂培养基：蛋白胨1 g/L、可溶性淀粉20 g/L、牛肉膏1 g/L、NaCl 5 g/L、K2HPO4 1 g/L、MgSO4 0.1 g/L、CaCl2 0.05 g/L、MnSO4 0.001 g/L、琼脂20 g/L，pH值7.0~7.2。淀粉酶培养基：蛋白胨1 g/L、可溶性淀粉10 g/L、酵母粉0.5 g/L、NaCl 1 g/L、K2HPO4 2 g/L、MgSO4 0.1 g/L、CaCl2 0.1 g/L、MnSO4 0.001 g/L，pH值7.0~7.2。以上培养基均经过121 ℃灭菌20 min，备用。1.2试验方法1.2.1菌株富集、筛选及纯化取2 g粉碎厨余置于150 mL富集培养基中，30 ℃培养48 h；取10 mL培养液置于新的150 mL富集培养液中，30 ℃培养48 h，共富集培养3代。取10 mL富集培养的菌液，70 ℃水浴20 min，10倍梯度稀释，选取适宜的稀释度，取100 μL涂布于淀粉琼脂培养基，30 ℃培养24~48 h。挑取生长良好、具有明显水解透明圈（卢戈氏碘液染色法，水解圈直径大于2倍细菌直径）的单菌落进行划线筛选及纯化，菌落涂片，革兰氏染色，镜检。筛选及纯化3代，纯化的菌株标记为S1~SN。1.2.2生化鉴定从平板上挑取革兰氏染色阳性菌落至装有2 mL灭菌生理盐水的指型管中，充分研磨，制成细菌悬液。按照HBI芽孢杆菌生化鉴定条的操作步骤进行芽孢杆菌生化反应测定。1.2.3溶圈试验取各菌株对数生长期菌液，点接种于淀粉琼脂培养基平板，30 ℃培养24 h，使用卢戈氏碘液染色，测定透明圈直径（H，mm）和细菌直径（C，mm），计算直径比（H/C）。1.2.4酶活性测定取2 mL对数生长期菌液，接种于100 mL淀粉酶培养基，30 ℃、120 r/min振荡培养48 h，4 000×g离心20 min，收集上清液，即为粗酶液，采用3，5-二硝基水杨酸比色定糖法（DNS）测定总淀粉酶活性、α-淀粉酶活性及β-淀粉酶活性[9-10]。酶活单位定义：1 mL粗酶液在40 ℃，每分钟水解淀粉生成1 μg麦芽糖所需酶量定义为一个酶活单位（U）。1.2.5分子生物学鉴定参考文献[11]、文献[12]，采用16S rRNA序列方法对S8和S10菌株进行鉴定。通用引物：27F：5'-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-TACGGCTACCTTGTT ACGACTT-3'。按照试剂盒的方法提取DNA模板，进行PCR反应，反应体系为50 μL：2×Buffer 25 μL、上下游引物各（10 μmol/L）2 μL、模板2 μL、ddH2O 19 μL。反应条件如下：94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，64 ℃、30 s，72 ℃、90 s，30个循环；72 ℃、5 min，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。测序工作由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，将测序所获得的16S rRNA序列提交至GeneBank数据库进行同源性比对，构建系统发育树，确定菌株S8和S10生物种属发育地位。1.2.6菌株S10酶学特征研究取一定量S10菌株对数生长期菌液，接种于50倍体积的淀粉酶培养基，30 ℃、120 r/min振荡培养48 h，4 000×g离心20 min，收集上清液，即为菌株S10的粗酶液，采用DNS测定总淀粉酶活力。酶活单位定义同1.2.4。1.2.6.1温度的影响取适量的粗酶液，分别在20、25、30、35、40、45、50、55、50、65 ℃下测定酶活性。1.2.6.2酶热稳定性取适量的粗酶液，分别在30、35、40、45、50 ℃不同温度下保温60 min，每隔10 min测定酶活性。1.2.6.3pH值的影响配制pH值分别为2.5、3.0、3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.6、7.0和7.6的磷酸盐缓冲液，35 ℃恒温测定不同pH值缓冲液中的酶活性。1.2.6.4酶的pH值稳定性将粗酶液溶于pH值5.6的磷酸盐缓冲液中，35 ℃恒温保存，分别放置1、2、4、8、12、16、24、36、48、72 h后，测定酶活性。1.2.6.5金属离子的影响以不加金属离子为对照，分别在粗酶液中加入终浓度为1 mmol/L的Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、Mn2+、Zn2+和Cu2+，测定酶活性。2结果与分析2.1菌株分离培养与染色镜检经过富集培养及筛选培养，试验共筛选出可以产生淀粉酶的菌株13株，菌株编号为S1至S13。筛选平板培养菌落，菌落直径4~6 mm，圆形或扁平形、边缘不规则、乳白色、不透明、表面有皱褶。芽孢杆菌染色镜检见图1。由图1可知，革兰氏染色呈阳性，光学显微镜检下，菌体粗大、杆状、有芽孢、孢囊不膨大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.016.F001图1芽孢杆菌染色镜检2.213株芽孢杆菌的生化试验（见表1）由表1可知，对分离到的13株进行生化试验，所有菌株淀粉试验阳性，均能在pH值为5.7的营养肉汤中生长，除菌株S10外，V-P试验均呈阳性，表明上述分离株符合芽孢杆菌的生化特征。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.016.T001表113株芽孢杆菌的生化试验菌株编号V-P测定淀粉明胶L-阿拉伯糖D-木糖D-甘露醇柠檬酸盐丙酸盐硝酸盐还原pH值5.77%氯化钠S1、S2、S5、S11++-+++--++-S3、S9+++---++++-S4、S7、S8、S12+++++++-+++S10-++++++--++S6、S13+++++++++++注：+表示阳性，-表示阴性。2.313株芽孢杆菌的溶圈试验（见表2）由表2可知，13株芽孢杆菌在淀粉琼脂培养基上都能产生较大的透明水解圈，菌株S8和S10在淀粉培养基上的透明圈直径较大，为21.4 mm和27.1 mm，直径比分别为5.2和6.3。菌株S8和S10溶圈试验见图2。由图2可知，2株菌株具有较强的淀粉降解能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.016.T002表213株芽孢杆菌溶圈试验菌株编号透明圈直径/mm菌落直径/mm直径比S114.04.03.5S212.53.93.2S318.14.34.2S415.84.53.5S515.64.23.7S613.74.72.9S717.64.53.9S821.44.15.2S919.44.34.5S1027.14.36.3S1121.05.04.2S1222.64.84.7S1317.94.73.810.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.016.F002图2菌株S8和S10溶圈试验2.413株芽孢杆菌的酶活性测定（见表3）由表3可知，菌株间产淀粉酶的能力差别显著，总淀粉酶活最低为134.9 U/mL，最高可达到329.7 U/mL。除菌株S10外，其他12株所产生的淀粉酶以α-淀粉酶为主，占比为53.0%~69.2%，其中S8菌株总淀粉酶活高达283.6 U/mL，α-淀粉酶活占比为69.2%。S10菌株总淀粉酶活最高，达到329.7 U/mL，其β-淀粉酶活占比为69.1%，α-淀粉酶活占比为30.9%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.016.T003表313株芽孢杆菌酶活测定菌株编号α-淀粉酶β-淀粉酶总淀粉酶S1112.7±10.483.1±9.7195.8±11.2S2108.3±8.679.3±8.9187.6±9.7S3130.4±9.9101.4±11.0231.8±10.5S497.2±8.686.2±9.1183.4±8.9S5128.1±10.989.6±9.5217.7±11.2S679.6±6.855.3±6.3134.9±8.8S7147.1±9.476.4±7.4223.5±9.5S8196.2±10.787.4±9.3283.6±10.1S9168.7±9.398.2±8.3266.9±9.9S10101.9±9.4227.8±10.6329.7±11.1S11139.7±10.187.6±7.9227.3±9.3S12177.5±9.092.7±6.9207.2±8.2S13133.3±7.489.4±5.7222.7±8.9U/mL2.5菌株S8和S10的菌株鉴定对菌株S8和S10的16S rRNA基因序列进行扩增，测序获得长1 502 bp和1 428 bp两个目的序列，将序列提交至NCBI数据库进行BLAST比对，利用MEGA5软件构建系统发育树。菌株S8和S10的16S rRNA基因序列系统发育树见图3。由图3可知，菌株S8与Bacillus subtilis DQ400916由同一节点分化出来，同源性最高；菌株S10与Bacillus amyloliquefaciens EF433406、Bacillus amyloliquefaciens AB255669共同汇聚成一支，同源性不如从同一节点分化，但同源性都在96%以上。综合形态、生化特征及系统发育树，确定S8属于枯草芽孢杆菌，S10属于解淀粉酶芽孢杆菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.016.F003图3菌株S8和S10的16S rRNA基因序列系统发育树2.6芽孢杆菌S10酶学特征研究2.6.1温度对S10芽孢杆菌产生的淀粉酶酶活性的影响（见图4）由图4可知，随着温度逐渐升高，酶活性先逐渐升高，35 ℃时，酶活性达到最高。然后，酶活性随着温度的升高而逐渐降低。至60 ℃时，酶活性基本消失。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.016.F004图4温度对S10芽孢杆菌产生的淀粉酶酶活的影响2.6.2S10芽孢杆菌产生的淀粉酶的热稳定性（见图5）由图5可知，菌株S10产生的淀粉酶酶活性在35 ℃和40 ℃，放置60 min后，残余相对酶活性分别为95.2%和89.2%。温度为50 ℃时，酶活性快速降低。可见，该淀粉酶在35~40 ℃之间具有很好的稳定性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.016.F005图5S10芽孢杆菌产生的淀粉酶的稳定性2.6.3pH值对S10芽孢杆菌产生的淀粉酶酶活性的影响（见图6）由图6可知，酶活性随着pH值的升高呈先上升后下降的趋势。菌株S10所产生的淀粉酶的最适pH值为5.6，此时酶活性最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.016.F006图6pH值对S10芽孢杆菌产生的淀粉酶酶活的影响2.6.4S10芽孢杆菌产生的淀粉酶的pH值稳定性（见图7）由图7可知，淀粉酶在pH值5.6的磷酸盐缓冲液中放置2 h，残余的酶活性依然在90%以上。然后，随着时间的延长，酶活性迅速下降。放置4 h和8 h，残余的相对酶活性分别为70.2%和37.4%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.016.F007图7S10芽孢杆菌产生的淀粉酶的pH值稳定性2.6.5金属离子对S10芽孢杆菌产生的淀粉酶酶活性的影响（见表4）由表4可知，Ca2+和Mn2+对酶活有较强的激活作用，可使酶活增强约1倍。Na+和K+对淀粉酶活有部分激活作用。Zn2+、Cu2+和Fe3+对酶活有明显的抑制作用，Mg2+对淀粉酶酶活基本没有影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.016.T004表4金属离子对S10芽孢杆菌产生的淀粉酶酶活影响金属离子相对酶活性对照100Na+129.5K+118.6Ca2+197.8Mg2+99.7Mn2+186.3Zn2+21.8Cu2+16.6Fe3+35.3%3讨论本研究从厨余中分离产淀粉酶菌株时，采用添加可溶性淀粉平板和碘液染色法染色进行初筛，产淀粉的菌落周围可以形成透明圈，透明圈和菌落直径的比值大小可以反映菌株产淀粉酶的能力，比值越大，说明菌株产淀粉酶越多，对淀粉的水解能力也越强。通过测定透明圈与菌落直径的比值，可直观判定产淀粉酶能力强弱，简化分离筛选过程。虽然采用测定透明圈与菌落的直径比，可以快速筛选出产淀粉酶菌株。但是，其直径比结果易受到平板厚度、接种量、菌体生长速度和培养时间等因素的影响，无法具体知道菌株所产淀粉酶酶活性究竟有多高，不同淀粉酶的酶活及占比情况。总淀粉酶酶活测定结果显示，13株菌株间总淀粉酶活性有明显的差别，最低酶活性为134.9 U/mL，而最高可以达到329.7 U/mL。除S10菌株外，其他12株芽孢杆菌产的淀粉酶以α-淀粉酶为主，其S8枯草芽孢杆菌产的α-淀粉酶活性最高，达到196.2 U/mL，占比为69.2%；S10解淀粉酶芽孢杆菌产的淀粉酶以β-淀粉酶为主，其酶活性为227.8 U/mL，占比为69.1%。16S rRNA存在于所有的原核生物，具有高度的保守性和分子计时器的特点。对菌株S8和菌株S10的16S rRNA基因序列进行比较分析，S8菌株与Bacillus subtilis AB201120、Bacillus subtilis DQ198162和Bacillus subtilis DQ400916同源性为99.8%~100%；S10菌株与Bacillus amyloliquefaciens AB255669、Bacillus amyloliquefaciens HQ231913、Bacillus amyloliquefaciens AB325583和Bacillus amyloliquefaciens EF433406同源性为96.4%~96.6%。综合形态、生化特征及16S rRNA基因序列分析，最后鉴定S8属于枯草芽孢杆菌，S10属于解淀粉酶芽孢杆菌。温度和pH值对酶活性的影响相当复杂。温度主要通过影响酶的构象来影响酶的反应速度，在适宜的温度范围内，酶的反应速度随着温度的升高而增加，但超过此温度范围后，酶的活性开始逐渐钝化，直至完全失活。反应液pH值的变化可以改变酶的空间结构或空间构象，影响酶与底物的结合，从而改变酶的反应动力学特征。本研究中，S10解淀粉芽孢杆菌所产的淀粉酶，最适反应温度在35 ℃左右；该酶在35~40 ℃具有很好的稳定性；pH值为5.6时，酶活最高，4 h内该酶活性依然在70%以上；Ca2+和Mn2+对酶活有较强的激活作用，与Invaova等[13]和Shen等[14]研究结果基本一致，说明S10菌株产的淀粉酶为Ca2+、Mn2+依赖型的淀粉酶。淀粉酶多在50~60 ℃、pH值接近中性时发挥作用，能够在酸性条件下水解淀粉的报道不多见[15]。本研究分离鉴定的S10解淀粉芽孢杆菌产的淀粉酶为中温偏酸性酶，具有较宽泛的温度和pH值适应性，在30~45 ℃和pH值4.6~6.0条件下稳定性好，在厨余发酵中具有很好的应用潜力和价值。4结论从厨余中分离13株产淀粉酶的芽孢杆菌，通过形态、生化特征及16S rRNA序列分析，鉴定S8属于枯草芽孢杆菌，S10属于解淀粉酶芽孢杆菌。S10解淀粉酶芽孢杆菌淀粉酶酶学性质测定结果显示，其最适温度为35 ℃，最适pH值为5.6，具有良好的稳定性，Ca2+、Mn2+、Na+和K+对淀粉酶酶活性有不同程度的激活作用，Zn2+、Cu2+和Fe3+对酶活性有明显的抑制作用。