鸡脂肪肝出血综合征（fatty liver hemorrhagic syndrome，FLHS）是由鸡肝脏脂质代谢发生紊乱引起肝脏的脂肪过度堆积和肝出血的一种营养代谢病[1]，严重危害养鸡业。外源注射雌激素与28 d的高脂日粮复合诱导，可有效建立FLHS模型鸡，FLHS鸡病理变化表现明显[2-4]。水飞蓟素是水飞蓟的提取物，具有抗氧化抗炎、免疫调节以及降血脂的功能。目前，水飞蓟素常用于各种肝胆疾病的治疗和预防[5-6]。本试验以北京油鸡为研究对象，通过建立FLHS模型，使用不同剂量水飞蓟素来预防FLHS，检测血清生化指标、肝脏出血指数、肝总脂含量和FLHS发生率，从而观察水飞蓟素对FLHS是否有预防效果，并初步研究讨论其作用机制。1材料与方法1.1仪器与试剂TG16G台式离心机（天津广丰科技有限公司）、DP8018VET全自动生化分析仪（广州东唐电子科技有限公司）、YD－12P生物组织全自动脱水机（金华市益迪医疗设备有限公司）、DHG－9070AS电热恒温鼓风干燥箱（江南玻璃仪器有限公司）。甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）试剂盒购自上海科兴商贸有限公司；苯甲酸雌二醇注射液购自博莱药业；水飞蓟素购自西安惠丰生化股份有限公司。1.2试验设计50只体重相近的1周龄北京油鸡预饲7 d后，将其随机分为5组，每组5个重复，每个重复2只鸡。FLHS模型组（A组）每天饲喂高脂日粮，肌肉注射2.5 mL/kg雌激素，每周3次；水飞蓟素低剂量组（B1组）饲喂高脂日粮，水飞蓟素按50 mg/kg拌料给药；水飞蓟素中剂量组（B2组）饲喂高脂日粮，水飞蓟素按100 mg/kg拌料给药；水飞蓟素高剂量组（B3组）饲喂高脂日粮，水飞蓟素按200 mg/kg拌料给药；每组均肌肉注射2.5 mL/kg雌激素，每周3次；对照组（O组）饲喂肉雏鸡基础日粮。本试验中的试验鸡分笼饲养，可避免地面饲养可能导致的其他疾病，尤其是鸡球虫病。光照为自然光，饮水和采食不做控制，饲养28 d。1.3试验日粮采用孙翔骁等[7]的方法设计肉雏鸡基础日粮和肉雏鸡高脂日粮。本试验使用商品肉用仔鸡前、中期全价颗粒料作为肉雏鸡基础日粮。将15%牛油融化后与85%肉雏鸡基础日粮搅拌均匀，作为本试验的肉雏鸡高脂日粮。基础日粮组成及营养水平见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.07.005.T001表1基础日粮组成及营养水平Tab.1Basic diet composition and nutritional level原料组成/%0~4周龄5~6周龄营养水平0~4周龄5~6周龄合计100.00100.00玉米59.6361.18粗蛋白/%20.0019.00豆粕26.0020.00钙/%1.000.90棉粕5.008.00总磷/%0.660.63菜粕3.004.00非植酸磷/%0.450.40豆油2.003.00赖氨酸/%1.251.15石粉1.371.12蛋氨酸+胱氨酸/%0.900.8磷酸氢钙1.701.40苏氨酸/%0.800.72食盐0.300.30代谢能/(MJ/kg)12.3812.76预混料1.001.00注：1.预混料为每千克日粮（0~4周龄）提供：I 0.7 mg、Se 0.3 mg、VA 8 000 IU、VD3 100 IU、VE 30 IU、VK 0.5 mg、硫铵素2.0 mg、核黄素8.0 mg、烟酸35 mg、VB6 3.5 mg、VB12 0.01 mg、泛酸10.0 mg、叶酸0.05 mg、生物素0.18 mg、氯化胆碱1.00 g、抗生素0.10 g、抗氧化剂0.4 g；预混料为每千克日粮（5~6周龄）提供：I 0.6 mg、Se 0.3 mg、VA 6 000 IU、VD3 500 IU、VE 20 IU、VK 0.5 mg、硫铵素2.0 mg、核黄素5.0 mg、烟酸30 mg、VB6 3.0 mg、VB12 0.01 mg、泛酸10.0 mg、叶酸0.05 mg、生物素0.15 mg、氯化胆碱1.00 g、抗氧化剂0.5 g。2.营养水平均为计算值。1.4样品采集饲养28 d时，对所有试验鸡进行心脏采血和肝脏取样保存。1.5测定指标及方法1.5.1血液生化指标按照ALT、AST、TG、TC试剂盒的说明书设置全自动生化分析仪检测程序，检测各项生化指标。1.5.2肝脏总脂含量采用索氏抽提法测定肝脏的肝总脂含量。肝总脂含量=（提取前滤纸包干重－提取后滤纸包干重）/（提取前滤纸包干重－滤纸干重）×100%（1）1.5.3肝脏出血指数和FLHS发生率将采样肝脏的出血点计数并记录，以计算肝脏出血指数，肝脏出血指数以Wolford评点法表示。Wolford评点法见表2。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.07.005.T002表2Wolford评点法Tab.2Wolford rating method肝脏出血指数评定依据0无出血点1.01~5个出血点2.06~15个出血点3.016~25个出血点4.025个出血点以上鸡脂肪肝出血综合征的判定方法如下：肝总脂含量超过正常对照组的正常个体肝总脂含量的20%，并且肝脏出血指数在2.0以及2.0以上的个体，即可判断发生了鸡脂肪肝出血综合征。FLHS发生率的计算方法为该组罹患FLHS的个体数与该组所有个体数的比值再乘以百分率即为FLHS发生率。1.6数据统计与分析试验数据使用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，最小显著性差异法（LSD）进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1水飞蓟素对油鸡血清生化指标的影响（见表3）由表3可知，与Q组相比，A组的血清生化指标数值均极显著升高（P0.01），表明鸡脂肪肝出血综合征模型制备成功，且水飞蓟素可有效抑制血清各生化指标的升高。水飞蓟素3个剂量组相比，血清中的TG和TC含量差异极显著（P0.01），且随水飞蓟素剂量增加而降低；水飞蓟素3个剂量组的AST活性无显著差异（P0.05）；B1组的ALT活性与B2、B3组相比极显著升高（P0.01），表明低剂量水飞蓟素保护肝细胞的作用与中、高剂量水飞蓟素相比较差。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.07.005.T003表3水飞蓟素对油鸡血清生化指标的影响Tab.3Effect of silymarin on serum biochemical indexes of oil chicken组别TG/(mmol/L)TC/(mmol/L)AST/(U/mL)ALT/(U/mL)O组0.05±0.04De1.16±0.14Dd143.73±8.59Bb24.82±4.65CcA组1.52±0.13Aa3.21±0.19Aa200.37±12.61Aa46.14±6.50AaB1组0.57±0.14Bb1.82±0.09Bb150.02±11.76Bb36.72±7.01BbB2组0.36±0.05Cc1.44±0.15Cc145.11±14.92Bb28.93±5.86CcB3组0.14±0.04Dd1.17±0.09Dd144.41±9.61Bb25.42±3.50Cc注 ：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2水飞蓟素对油鸡肝总脂含量、肝脏出血指数及FLHS发生率的影响（见表4）由表4可知，A组与O组相比肝总脂含量极显著升高（P0.01）；A组与水飞蓟素三个剂量组的肝总脂含量相比极显著升高（P0.01），水飞蓟素3个剂量组之间相比肝总脂含量没有显著性差异（P0.05）。结果表明，水飞蓟素可以有效降低肉鸡肝总脂含量。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.07.005.T004表4水飞蓟素对油鸡肝总脂含量、肝脏出血指数及FLHS发生率的影响Tab.4Effect of silymarin on total liver lipid content, hepatic bleeding index and FLHS incidence of oil chicken组别肝总脂含量/%出血指数FLHS发生率/%O组14.98±2.10Bb1.09±0.16Bc0A组23.34±3.83Aa2.61±0.46Aa90B1组17.69±4.03Bb1.61±0.34Bb10B2组17.11±3.62Bb1.31±0.14Bc0B3组15.44±3.47Bb1.14±0.18Bc0A组与O组相比肝脏出血指数极显著升高（P0.01）；A组与水飞蓟素3个剂量组相比肝脏出血指数极显著升高（P0.01），B2、B3组与B1组的肝脏出血指数相比显著降低（P0.05）。结果表明，水飞蓟素可以有效降低肉鸡肝脏出血指数，且随剂量升高预防效果也提高。A组与O组相比FLHS发生率极显著升高，表明该试验成功建立了鸡脂肪肝出血综合征模型。水飞蓟素3个剂量组与A组相比FLHS发生率极显著降低，表明水飞蓟素对鸡脂肪肝出血综合征的发生有着良好的预防作用；B1组仍然有鸡脂肪肝出血综合征的发生，而B2和B3组未出现鸡脂肪肝出血综合征，表明随着水飞蓟素剂量的增加，对鸡脂肪肝出血综合征的预防效果也增强。3讨论肝细胞是转氨酶产生的主要场所。因此，在肝细胞中AST和ALT的活性要远远高于在血清中的活性。而肝脏病变会使肝细胞受损，转氨酶释放进入血液，导致血清中的AST与ALT活性异常升高。所以判断肝功能异常的重要指标就是血清转氨酶活性[8]。当肉鸡发生FLHS时，脂质代谢发生紊乱，其体内进入肝脏的游离脂肪酸难以被代谢出去，并且沉积在肝细胞内，引起肝脏的脂肪过度堆积[9-10]，导致FLHS鸡血清ALT与AST活性出现大幅上升，同时TG与TC含量也显著升高。因此，检查肉鸡是否罹患FLHS可检测其血清TG、TC含量及ALT、AST活性[11-12]。FLHS与肝总脂含量、肝脏出血指数具有直接关系，当肉鸡发生FLHS时，肝总脂含量和肝脏出血指数与正常对照组肉鸡相比极显著升高，水飞蓟素3个剂量组肉鸡与FLHS模型组肉鸡相比肝总脂含量和肝脏出血指数极显著降低；而FLHS发生率和肝总脂含量、肝脏出血指数具有直接关系，表明水飞蓟素可以降低肉鸡肝脏脂肪沉积，减少肝脏出血点数量及出血点大小，从而降低FLHS发生概率。本试验中，低剂量的水飞蓟素对肝细胞的保护作用不够强，而中高剂量的水飞蓟素对FLHS的预防效果更好，且剂量越高，预防效果越好，说明肝细胞对水飞蓟素具有一定的剂量依赖性。因此，水飞蓟素能够显著降低血清中ALT、AST的活性和血清TG和TC的含量，其机制可能是通过抑制自由基和炎性因子的产生，从而减少肝细胞脂肪沉积，提高肝脏抗氧化能力以维持血清各生化指标于正常区间，缩小肉鸡肝脏脂肪变性区域，减小肝脏出血点数量及出血点大小[13-15]，保肝利胆，从而降低FLHS的发病率和死亡率。4结论水飞蓟素对鸡脂肪肝出血综合征具有良好的预防效果，可有效降低由于鸡脂肪肝出血综合征导致的一系列症状。