当前，饲料资源供需矛盾加剧，成为限制畜牧业发展的重要因素之一。开发非常规饲料资源是解决饲料资源短缺问题的有效途径。用非常规饲料代替常规饲料，可以减少资源浪费、降低环境污染，对畜牧业的可持续发展有重要意义[1]。结合现代生物技术开发地源性非常规饲料资源受到越来越多的重视。葡萄籽粕是葡萄酒产业下脚料，是压榨葡萄籽油的副产品，其价格低廉、来源广泛[2]。葡萄籽粕因纤维含量过高、蛋白含量较低，限制其在动物生产中的利用。因此，采用现代生物技术提高葡萄籽粕的饲用价值，充分开发和利用葡萄籽粕资源具有重要意义。本研究采用微生物发酵技术，通过筛选优势菌种和发酵条件优化，确定最佳发酵菌种和发酵条件。在此基础上，对发酵后葡萄籽粕的营养成分变化进行分析，以期为新疆地源性饲料资源葡萄籽粕的开发与高效利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验原料葡萄籽粕由新疆西部牧业有限股份公司提供；麸皮、玉米购自新疆石河子市农贸市场。酵母菌（酿酒酵母、热带假丝酵母）、乳酸菌（嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌）、枯草芽孢杆菌由石河子大学动物科技学院生物饲料生物技术实验室保存。1.1.2培养基乳酸菌培养基：MRS固体培养基、MRS液体培养基；酵母菌培养基：YPD固体培养基、YPD液体培养基；枯草芽孢杆菌培养基：LB固体培养基、LB液体培养基,均购自培养基购自青岛海博生物技术有限公司。1.1.3发酵底物葡萄籽粕∶玉米∶麸皮=90∶5∶5，混合均匀，底物水含量为40%，121 ℃、0.1 MPa灭菌15 min。1.1.4试验试剂硫酸铜、氢氧化钠、盐酸、氢氧化钠、硫酸、硼酸、甲基红、溴苯酚绿、石油醚、丙酮、乙二胺四乙酸二钠、十二烷基硫酸钠、乙二醇乙醚、无水磷酸氢二钠、十六烷三甲基溴化铵等均为分析纯。1.1.5仪器设备超净工作台（SW-CJ-22，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、恒温培养箱（GSP-9270MBE，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、电热鼓风干燥箱（101-3AB，天津泰斯特仪器有限公司）、高压灭菌锅（MLS－3750，日本sanyo）、恒温振荡培养箱（BSD-TX318，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、电子天平（BS224，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、粉碎机（FW－80，北京市永光明医疗仪器有限公司）、控温消煮炉（LWY84B，江苏盛蓝仪器制造有限公司）。1.2试验方法1.2.1种子液制备分别取酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌菌种于无菌条件下划线培养于YPD、MRS、LB固体培养基上，分别在30、37、37 ℃培养24 h，挑取1环接种在5 mL液体培养基中，分别在30、37、37 ℃，180 r/min恒温培养24 h（一级菌种）；取一级菌种接入100 mL液体培养基中，分别在30、37、37 ℃培养20、24、24 h（二级菌种），作为发酵菌种。1.2.2菌种筛选在装有100 g已灭菌底物的500 mL锥形瓶中，分别加入酵母菌（酿酒酵母、热带假丝酵母）、乳酸菌（嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌）、枯草芽孢杆菌菌液，接种量8%，纱布封口。酵母菌30 ℃恒温培养48 h，乳酸菌及枯草芽孢杆菌37 ℃恒温培养48 h。发酵结束后，45 ℃烘干，粉碎过80目筛，待测。1.2.3发酵条件单因素试验设计在确定发酵菌株的基础上，根据预试验情况，选取菌液接种量、底物含水量、发酵温度和发酵时间4个因素进行单因素试验。1.2.3.1底物水含量对发酵饲料中酸溶蛋白含量的影响底物水含量选择35%、40%、45%、50%、55%，接种量6.0%，发酵温度30 ℃，发酵时间48 h。1.2.3.2发酵时间对发酵饲料中酸溶蛋白含量的影响发酵时间选择24、36、48、60、72 h，接种量6.0%，底物水含量40%，发酵温度30 ℃。1.2.3.3发酵温度对发酵饲料中酸溶蛋白含量的影响发酵温度选择28、30、32、34、36 ℃，接种量6.0%，底物水含量40%，发酵时间48 h。1.2.3.4接种量对发酵饲料中酸溶蛋白含量的影响菌液接种量2%、4%、6%、8%、10%，发酵温度30 ℃，发酵时间48 h，底物水含量40%。1.2.4正交试验设计发酵工艺优化采用4因素3水平正交试验，共设12个处理，每个处理3个重复。各参数水平根据单因素试验结果，分别选取3个较好的水平，选择菌液接种量、底物含水量、发酵温度和发酵时间4个因素进行正交试验，随后以酸溶蛋白为指标筛选出优化组合。1.3营养成分测定根据GB/T 20806—2006测定酸性洗涤纤维含量；参照钟鸣等[3]的方法，利用半微量蒸馏法测定挥发性盐基氮含量；参照QB/T 22492—2008《大豆肽粉》，利用三氯乙酸法测定酸溶蛋白含量；粗蛋白、粗脂肪、粗灰分等常规营养成分测定方法参照张丽英[4]的研究方法。1.4数据统计与分析应用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），采用Duncan氏法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。运用DPS软件的相似优先比方法比较不同益生菌与参考样本间各指标的相似程度，排序。将发酵葡萄籽粕3个指标进行分析计算，对其给予识别表示为1，固定样本即参考发酵方法，识别表示为0。执行“模糊相似优先比分析”功能，将酸溶蛋白含量及挥发性盐基氮的增加、酸洗洗涤纤维含量的减少的权重设定为0.5、0.3、0.2。计算结果中待测样与参考发酵方法的相似程度大小即反映。样本的序号值越小，该样本与固定样本相似程度接近[5]。2结果与分析2.1葡萄籽粕预消化微生物菌种的筛选（见表1、表2）分别选取酵母菌（酿酒酵母、热带假丝酵母）、乳酸菌（嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌）、枯草芽孢杆菌等5种益生菌对葡萄籽粕分别进行微生物发酵预消化，以酸溶蛋白含量为主要评价指标，酸性洗涤纤维及挥发性盐基氮为次要评价指标筛选出1株较好的益生菌。由表1可知，不同益生菌发酵均可以显著提高葡萄籽粕的酸溶蛋白含量（P0.05），热带假丝酵母的提高效果最佳，可使酸溶蛋白含量达到0.68%；除了热带假丝酵母及嗜乳酸杆菌，其余益生菌均可以显著降低酸性洗涤纤维含量（P0.05）；枯草芽孢杆菌试验组的挥发性盐基氮含量最低，显著低于其他试验组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.014.T001表1运用不同益生菌发酵葡萄籽粕营养成分分析组别酸溶蛋白/%酸性洗涤纤维/%挥发性盐基氮/（mg/kg）对照组0.20±0.03c48.58±1.72a18.90±0.02d热带假丝酵母0.68±0.03a44.52±0.68ab55.99±0.99a酿酒酵母0.57±0.06b43.29±0.82b52.48±0.02a嗜乳酸杆菌0.57±0.02b45.18±0.29ab52.47±3.96a保加利亚乳杆菌0.49±0.02b43.75±3.03b44.78±0.99b枯草芽孢杆菌0.52±0.06b43.15±1.91b39.20±0.99c注：同列数据肩标字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05），字母不同表示差异显著（P0.05）；下表同。依据DPS软件求得各品种与参考样本间各指标的相似序号之和。相似度越小，该处理组综合价值越高。由表2可知，综合排序：酿酒酵母=枯草芽孢杆菌热带假丝酵母嗜酸乳杆菌保加利亚乳杆菌。酿酒酵母对发酵葡萄籽粕酸溶蛋白含量提高作用优于枯草芽孢杆菌。因此，选取酿酒酵母进行后续发酵条件的工艺优化。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.014.T002表2不同微生物发酵与参考样本相似程度及营养价值排序种类酸溶蛋白酸性洗涤纤维挥发性盐基氮相似程度排序热带假丝酵母14592酿酒酵母21471嗜乳酸杆菌353113保加利亚乳杆菌532104枯草芽孢杆菌421712.2发酵条件单因素试验结果2.2.1接种量对发酵饲料中酸溶蛋白含量的影响（见图1）由图1可知，当菌液接种量在2%~4%时，酸溶蛋白含量的变化不明显；当菌液接种量为6%时，酸溶蛋白的含量达到0.54%，为峰值；然后逐渐降低，可能是因为葡萄籽粕中的营养物质已被益生菌分解利用。因此，菌液接种量为6%时最佳。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.014.F001图1接种量对发酵饲料中酸溶蛋白含量的影响2.2.2发酵温度对发酵饲料中酸溶蛋白含量的影响（见图2）由图2可知，随着温度的提高，发酵葡萄籽中酸溶蛋白含量呈现出先上升后下降的趋势。酿酒酵母的最适培养温度为28~30 ℃，酸溶蛋白含量在这阶段逐渐上升，在30 ℃时达到最大，为0.55%；当温度逐渐升高后，使酵母菌的生长受到抑制，使酸溶蛋白含量降低。因此，发酵温度为30 ℃时最佳。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.014.F002图2发酵温度对发酵饲料中酸溶蛋白含量的影响2.2.3底物水含量对发酵饲料中酸溶蛋白含量的影响（见图3）由图3可知，当底物水含量在35%~40%时，发酵葡萄籽粕的酸溶蛋白含量呈现上升趋势；随着底物水含量的继续增加，酸溶蛋白含量呈现逐渐降低趋势。当底物水含量处于较低水平时，发酵底物中溶解的营养物质少，微生物生长受到抑制；当底物水含量过高时，会增加发酵底物的黏稠度，使氧气量减少，不利于好氧菌的气体交换，从而使益生菌的生长代谢受到影响[6]。因此，底物水含量为40%时最佳。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.014.F003图3底物水含量对发酵饲料中酸溶蛋白含量的影响2.2.4发酵时间对发酵饲料中酸溶蛋白含量的影响（见图4）由图4可知，当发酵时间在24~60 h时，发酵葡萄籽的酸溶蛋白含量随着时间的延长而逐渐增加。在60 h时，酸溶蛋白含量达到最高值50%，然后逐渐下降。发酵时间过短，微生物代谢作用未得到完整发挥，不能得到最优质的发酵产品；发酵时间过长，发酵底物中的营养物质消耗过多，不利于益生菌生长代谢，造成菌体消融，益生菌的优势减弱，有害菌生长繁殖，致使发酵产品品质降低[7]。因此，发酵时间为60 h时最佳。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.014.F004图4发酵时间对发酵产物中酸溶蛋白含量的影响2.3正交试验结果在单因素试验的基础上，选取底物含水量（A）、发酵时间（B）、发酵温度（C）和菌液接种量（D）为试验因子，L9（34）正交试验因素与水平设计见表3，共设12个处理，每个处理3个重复。以发酵产物酸溶蛋白含量为评价指标，正交试验设计及试验结果见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.014.T003表3L9（34）正交试验因素与水平设计水平A/%B/hC/℃D/%14048282245603043507232610.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.014.T004表4正交试验设计及试验结果编号ABCD酸溶蛋白含量/%111110.49b212220.48b313330.43c421230.55a522310.40c623120.51ab731320.48b832130.52ab933210.50bk10.470.510.510.46k20.490.470.510.49k30.460.480.440.50R0.030.040.070.04由表4可知，因素A、B、C、D对发酵葡萄籽粕的酸溶蛋白含量影响程度为CBDA，即温度对发酵效果影响最大，底物水含量的影响效果最小。由k值可知，最佳发酵工艺为A2B1C2D3。底物水含量45%、发酵时间48 h、发酵温度30 ℃、菌液接种量为6%的条件下，发酵品质最佳，经试验测定酸溶蛋白含量为0.55%。2.4葡萄籽粕发酵前后的营养成分变化（见表5）由表5可知，经过微生物发酵的葡萄籽粕的酸溶蛋白、粗蛋白、干物质、脂肪含量均有不同程度的提高，灰分、中性洗涤纤维及酸性洗涤纤维含量有所下降。运用酿酒酵母发酵的葡萄籽粕中酸溶蛋白含量和粗蛋白含量分别提高175%、18.5%，脂肪含量提高13.37%，中性洗涤纤维及酸性洗涤纤维含量分别下降4.66%、3.93%，钙、磷含量无变化。结果表明，微生物发酵葡萄籽粕可改善饲料原料的品质，提高利用价值。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.10.014.T005表5葡萄籽粕发酵前后的营养成分变化（干物质基础）营养成分对照组益生菌发酵酸溶蛋白0.200.55粗蛋白9.1110.80干物质98.3098.92灰分5.094.74脂肪10.9112.38中洗洗涤纤维60.8558.01酸性洗涤纤维48.5846.67钙0.420.42磷0.210.21%3讨论微生物发酵可将饲料原料中的大分子蛋白水解为小分子蛋白或游离氨基酸，使饲料中的肽类物质含量提高，从而提高动物的饲料利用率[8]。肽含量的高低与酸溶蛋白含量呈显著正相关[9]。因此，饲料行业经常以酸溶蛋白含量来评价饼粕类饲料的蛋白质品质。挥发性盐基氮（TVB-N）是饲料在酶和细菌的作用下，蛋白质分解产生的氨以及胺类等碱性含氮物质[10]。当蛋白质分解程度过高时，产生的游离氨基酸会被脱羧酶催化脱羧产生胺类化合物，使挥发性盐基氮的含量升高，表明饲料中原有氨基酸被破坏的数量增多[11]。挥发性盐基氮含量过高会对产品营养价值产生负面影响。葡萄籽粕中纤维含量较高，酸性洗涤纤维中的木质素对动物无营养价值。畜禽可以通过微生物发酵利用部分纤维素及半纤维素，利用微生物发酵使发酵葡萄籽粕中的酸性洗涤纤维含量显著降低。因此，本研究用酸溶蛋白、挥发性盐基氮及酸性洗涤纤维含量作为考察发酵葡萄籽粕品质的指标。单因素试验结果表明，底物含水量、发酵时间、发酵温度和菌液接种量均有双重作用。水含量是影响益生菌在底物中生长代谢的重要因素[12]。水含量过高会限制益生菌的生长代谢，使葡萄籽粕的发酵产物酸溶蛋白含量下降。发酵时间也是影响发酵葡萄籽粕品质的重要因素。发酵60 h后，酸溶蛋白含量逐渐下降，可能因为发酵底物中提供益生菌生长需要的碳源及氮源消耗过多，发酵环境不利于微生物生存[13]。固态发酵过程传热性较差，随着发酵温度升高，发酵底物会消耗氧气产生热量，热量聚积，造成部分蛋白酶失活[14]。因此，发酵温度对微生物生长和代谢中产生的蛋白酶活性影响较大，选择合适的发酵温度非常重要。本研究发现，酿酒酵母的最适温度在28~30 ℃。温度过低时，酿酒酵母生长缓慢，代谢产物较少，提高酸溶蛋白含量的能力减弱；温度过高时，酿酒酵母生长繁殖受到抑制，发酵能力变弱，酸溶蛋白含量也随着下降。菌液接种量也是影响发酵产品品质的要因素。接种量过低时，益生菌数量过少，生产代谢速率较慢；接种量过高时，底物中的营养物质消耗速度过快，影响后期的益生菌生长繁殖，影响葡萄籽粕的发酵效果。本试验发现，采用微生物发酵技术可以改善葡萄籽的营养品质，提高葡萄籽粕中酸溶蛋白含量，降低纤维含量。使用酿酒酵母发酵葡萄籽粕时，酸溶蛋白含量增加，原因为酵母菌细胞内含有大量的蛋白质、氨基酸；随着发酵的进行，在酵母菌的生长繁殖代谢中产生营养活性物质，如酒石酸、苹果酸、柠檬酸等有机酸，可通过三羧酸循环参与酶促反应，使蛋白酶分解大分子蛋白速度加快；微生物可以将饲料中非蛋白氮转化为可被畜禽吸收利用的蛋白氮；酵母菌在发酵过程中可以产生蛋白酶[15-17]。亓秀晔等[18]发现，利用酵母菌对哺乳母猪全价饲料进行生物发酵，可以使饲料的粗蛋白含量提高5.41%，酸溶蛋白含量提高23.41%，总酸含量达20.68 mg/g。蒋慧姣等[19]通过微生物发酵木薯渣，发现木薯渣的粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量提高，中性洗涤纤维含量降低。本研究表明，微生物发酵葡萄籽粕可以有效提高酸溶蛋白、粗蛋白含量，降低中性洗涤纤维及酸性洗涤纤维含量，消除饲料中的抗营养因子，改善饲料原料的品质。4结论本试验筛选出发酵葡萄籽粕的优势菌种为酿酒酵母，利用单因素试验和正交试验对酿酒酵母发酵葡萄籽粕条件进行优化，得到最佳发酵条件：底物水含量45%、发酵时间48 h、发酵温度30 ℃、菌液接种量为6%。在该条件下，酸溶蛋白含量为0.55%，比未发酵的对照组提高175%。