辣木（Moringa oleifera）为辣木科（Moringaceae）辣木属（Moringa Adans.）多年生乔木，别名“油辣木”和“鼓槌树”。我国辣木主要分布在广西、广东、云南、福建等地[1]。辣木含有丰富的矿物元素、纤维、油、蛋白质、维生素和甾醇等，且含有人体无法自行合成的必需游离氨基酸[2-3]。辣木及其相关产品在我国被列为药食两用食品资源[4-5]。氨基酸是辣木叶营养成分之一，其种类多达19种，其中9种是人体所必需的[6]。目前，关于辣木叶游离氨基酸的研究主要有2方面：一是辣木叶游离氨基酸的组成分析与营养评价[7-9]；二是不同种质资源辣木叶游离氨基酸的含量比较与分析[10]。目前，国内植物中游离氨基酸的提取采用热水浸提法[11-12]、酶辅助提取法[13]、微波辅助提取法[14]以及超声波辅助提取法[15-16]等。超声波有提取温度低、提取率高和耗时短等优势，广泛应用于物质提取。本试验使用联合超声波技术处理辣木叶，研究乙醇浓度、超声波时间、超声波温度、超声波功率对提取辣木叶游离氨基酸的影响，通过响应面法将提取工艺进一步优化，为加快对辣木叶游离氨基酸的开发利用提供参考依据。1材料与方法1.1试验材料辣木叶由广西宁明县辣桐之源辣木种植基地提供。新鲜辣木叶清洗，60 ℃的烘箱烘干水分，恒重，粉碎过60目筛，分装于食品保鲜袋中，干燥箱内保存，备用。1.2试验仪器与试剂Agilent 8453型紫外可见分光光度仪（美国安捷伦科技公司）、AUW220D型十万分之一天平（日本岛津公司）、KQ2200DE型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）、FW135型多功能粉碎机（北京市永明医疗仪器有限公司）。无水醋酸钠、冰醋酸、茚三酮、异丙醇、甘氨酸、无水乙醇（化学纯，国药集团化学试剂有限公司）。1.3单因素试验设计1.3.1乙醇浓度对辣木叶游离氨基酸提取的影响准确称量辣木叶干粉1.000 g于100 mL的锥形瓶中，加入乙醇溶液60 mL，设置超声波温度40 ℃、超声波时间30 min、超声波功率125 W，分别在乙醇体积分数为15%、20%、25%、30%、35%的条件下浸提，浸提液过滤于锥形瓶中。滤液中加入活性炭2.0 g，65 ℃水浴中脱色60 min，取出，冷却，5 000 r/min离心15 min。将离心液移至100 mL的容量瓶，蒸馏水定容，备用。1.3.2超声波时间对辣木叶游离氨基酸提取的影响准确称量辣木叶干粉1.000 g于100 mL的锥形瓶中，加入25%乙醇溶液60 mL，设置超声波温度40 ℃、超声波功率125 W，分别超声提取30、45、60、75、90 min，浸提液过滤于锥形瓶中。于滤液中加入活性炭2.0 g，在65 ℃水浴中脱色60 min，取出冷却，5 000 r/min离心15 min。将离心液移至100 mL的容量瓶，蒸馏水定容，备用。1.3.3超声波温度对辣木叶游离氨基酸提取的影响准确称量辣木叶干粉1.000 g于100 mL的锥形瓶中，加入25%乙醇溶液60 mL，设置超声波时间30 min、超声波功率125 W，分别在超声波温度30、40、50、60、70、80 ℃的条件下浸提，浸提液过滤于锥形瓶中。于滤液中加入活性炭2.0 g，在65 ℃水浴中脱色60 min，取出冷却，5 000 r/min离心15 min。将离心液移至100 mL的容量瓶，蒸馏水定容，备用。1.3.4超声波功率对辣木叶游离氨基酸提取的影响准确称量辣木叶干粉1.000 g于100 mL的锥形瓶中，加入25%乙醇溶液60 mL，设置超声波温度40 ℃、超声波时间30 min，分别在超声波功率100、125、150、175、200 W的条件下浸提，浸提液过滤于锥形瓶中。于滤液中加入活性炭2.0 g，在65 ℃水浴中脱色60 min，取出冷却，5 000 r/min离心15 min。将离心液移至100 mL的容量瓶，蒸馏水定容，备用。1.4响应面试验设计依照单因素试验所得的结果，采用Design-Expert 8.0软件，根据Box-Benhnken的中心组合试验的相关工艺原理，以乙醇浓度（A）、超声波时间（B）、超声波温度（C）和超声波功率（D）这4种因素设计响应面，具体因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.T001表1Box-Behnken 因素水平设计水平A/%B/minC/℃D/W-1203030100025454012513060501501.5游离氨基酸标准曲线（见图1）参照李洪斌等[17]、李梅等[18]的方法并稍做改进。分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的5 mg/L的甘氨酸标准溶液至20 mL试管，加入1 mL醋酸盐缓冲液和2 mL水合茚三酮显色剂，70 ℃水浴15 min，冷却至室温，加蒸馏水至10 mL，振荡均匀后，在570 nm下测定吸光值。以吸光度为纵坐标，游离氨基酸含量为横坐标，得到回归方程：y=1.754 3x-0.008 8，R2=0.999 4，式中y为吸光值的大小，x为游离氨基酸浓度的值。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.F001图1游离氨基酸标准曲线1.6游离氨基酸的测定准确吸取辣木叶游离氨基酸提取液1.00 mL至20 mL试管，按1.5分别添加显色剂，70 ℃水浴15 min，冷却至室温，加蒸馏水至10 mL，振荡均匀，在570 nm下测定吸光值，按照通过标准曲线得到的线性回归方程对辣木叶中的游离氨基酸提取量进行计算：游离氨基酸提取量(mg/g)=x×v×10－3/W(1)式中：x为游离氨基酸浓度(mg/L)；v为提取液体积(mL)；W为样品的质量(g)。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1乙醇浓度对辣木叶游离氨基酸提取量的影响（见图2）由图2可知，乙醇浓度在15%~25%时，随着浓度的上升，辣木叶游离氨基酸提取量随之提高，在乙醇浓度为25%时其提取量达最高值，为94.72 mg/g；当乙醇浓度超过25%后，辣木叶游离氨基酸提取量呈下降趋势；乙醇浓度为30%和35%时，叶游离氨基酸提取量降低，可能是在高浓度的乙醇条件下，氨基酸和乙醇的极性相似度降低，导致氨基酸提取量降低。因此，选择乙醇浓度为20%、25%和30%为考察水平比较合适。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.F002图2乙醇浓度对辣木叶游离氨基酸提取量的影响2.1.2超声波时间对辣木叶游离氨基酸提取的影响（见图3）由图3可知，超声波时间在30~45 min时，辣木叶游离氨基酸提取量呈上升趋势，在超声波时间为45 min时到达最高值，为113.65 mg/g；超声波时间超过45 min之后，随着时间的增加辣木叶游离氨基酸提取量呈下降趋势，且下降幅度较大；超声波时间超为90 min时，辣木叶游离氨基酸提取量下降至81.25 mg/g，可能是长时间的超声波提取，使细胞内游离氨基酸以外其他成分也被提取出来，影响游离氨基酸的提取量。因此，选择提取时间30、45、60 min为考察温度水平比较合适。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.F003图3超声波时间对辣木叶游离氨基酸提取的影响2.1.3超声波温度对辣木叶游离氨基酸提取量的影响（见图4）如图4可知，在一定范围内，扩散系数随着温度的变化而变化，溶剂的渗透能力也相应增加，更快进入物质内部中，使得有效成分提取率提高。当超声波温度为40 ℃时，提取率到达最高值，为103.36 mg/g；当超声波温度在40 ℃以上时，辣木叶游离氨基酸提取量总体呈下降趋势，且温度越高下降的幅度增大；超声波温度为70 ℃其提取量下降至58.62 mg/g，可能是在较高温度条件下游离氨基酸被分解，因而导致提取量下降。因此，可以选择提取温度30~50 ℃为考察温度大小较为适合。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.F004图4超声波温度对辣木叶游离氨基酸提取量的影响2.1.4超声波功率对辣木叶游离氨基酸提取量的影响（见图5）由图5可知，超声波可以促使细胞破裂，加快细胞内部物质的释放。当超声波功率从100 W上升至125 W时，辣木叶游离氨基酸提取量达最大值，为109.47 mg/g；当超声波功率超过125 W后，随着超声波功率的增大，游离氨基酸提取量呈下降趋势，在超声波功率为150、175、200 W时，游离氨基酸提取量分别为降至96.35、83.52、81.65 mg/g，可能是在超声波功率较大的条件下，物质细胞破裂加快，使得其他成分也得到释放，从而导致游离氨基酸提取量呈下降趋势。因此，选择功率为100~150 W考察比较合适。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.F005图5超声波功率对辣木叶游离氨基酸提取量的影响2.2响应面优化试验结果2.2.1模型建立及显著性检（见表2、表3）根据单因素试验结果，按照表1设计进行响应面试验，响应面方案分析及结果见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.T002表2响应面分析方案及结果试验编号ABCD游离氨基酸提取量/(mg/g)120454010090.812204540150107.15320455012589.05420304012587.565204530125104.646206040125100.647254540125113.128254540125115.78925304010091.751025305012588.7211256030125100.3012254540125106.381325303012590.441425455010093.4015256040150106.5516254530150108.6717254540125115.871825304015091.221925605012595.352025604010099.882125453010093.602225455015099.6423254540125107.162430453012599.2225304540150100.012630604012594.9927303040125103.902830455012599.4729304540100113.15其中，自变量包括乙醇浓度、超声波时间、超声波温度、超声波功率，响应值为游离氨基酸提取量，通过Design-Expert软件展开二次多元回归拟合计算，获得了辣木叶游离氨基酸提取量与乙醇浓度、超声波时间、超声波温度、超声波功率的多元二次回归方程为：Y(游离氨基酸产量的预测值)=111.66+2.57A+3.68B-2.60C+2.55D-5.50AB+3.96AC-7.37AD-0.81BC+1.80BD-2.21CD-4.93A2-9.84B2-8.44C2-4.27D2 (2)回归方程表明，影响辣木叶游离氨基酸提取量的最大因素是超声波时间，其次是超声波温度，超声波功率的影响最小。由表3可知，一次项A乙醇浓度、C超声波温度、D超声波功率、交互项AB和二次项D2的影响是显著的（P0.05），一次项B超声波时间、交互项AD和二次项A2、C2、B2的影响是极显著的（P0.01）。该模型整体回归公式的显著性较高，为极显著（P0.000 1），失拟项P值为0.791 2，失拟性差异不显著，代表方程具有良好的试验拟合，仅具有较小的误差，所以可以通过此模型预测及分析辣木叶游离氨基酸的提取方法，利用此模型优化辣木叶游离氨基酸的提取，具有较高的预测性和科学可信度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.T003表3方差分析结果方差来源方差和自由度方差F值P值显著性模型1 793.1314128.088.790.000 1**A79.46179.465.450.034 9*B162.221162.2211.130.004 9**C81.35181.355.580.033 1*D78.26178.265.370.036 1*AB120.961120.968.30.012 1*AC62.74162.744.310.056 9—AD217.321217.3214.920.001 7**BC2.6212.620.180.677 7—BD12.92112.920.890.362 4—CD19.47119.471.340.267 0—A2157.561157.5610.810.0054**B2628.221628.2243.120.000 1**C2462.031462.0331.710.000 1**D2118.491118.498.130.012 8*残差203.961414.57———失拟项119.051011.910.560.791 2—纯误差84.91421.23———总变异1997.1028————注：*表示差异显著（P0.05），**表示差异极显著（P0.01）。2.2.2响应面交互作用分析通过Design-Expert 8.0软件，将各试验因素与响应值以及各试验因素交互作用制成三维曲面图，两因素间的交互作用对辣木叶游离氨基酸提取量的影响见图6，考察乙醇浓度、超声波时间、超声波温度及超声波功率中任意一个因素水平为0时，辣木叶游离氨基酸提取量受其他因素的影响，两因素叠加作用可通过响应面的立体图式直观表示出来。由图6可知，试验考察4个因素中两两间所形成的曲面图均有一定坡度，其中乙醇浓度与超声波时间、乙醇浓度与超声波功率的曲面坡度陡峭较大，且其等高线较为密集或形状为近椭圆形，说明乙醇浓度与超声波时间、乙醇浓度与超声波功率两两因素间呈现的交互作用均较明显，与表3的显著性分析是一致的。由Design-Expert 8.0软件拟合得到的辣木叶游离氨基酸的最有效果工艺条件为：乙醇浓度为24.38%，提取时间为53.7 min，提取温度为44.6 ℃，超声功率为125 W，在此条件下游离氨基酸提取量为115.39 mg/g。图6两因素间的交互作用对辣木叶游离氨基酸提取量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.F6a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.F6a210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.F6a310.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.F6a410.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.F6a510.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.F6a62.2.3提取工艺优化及验证（见表4）为了验证响应面模型得到的工艺条件的可靠性，本试验按上述优化的提取工艺条件对辣木叶游离氨基酸进行提取。由于需要结合生产的实际问题进行考虑，通过响应面优化分析得到的各因子，把最优的理论值调整为：乙醇浓度为25%，提取时间为54 min，提取温度为45 ℃，超声功率为125 W。在此条件下进行了5次重复试验。由表4可知。辣木叶游离氨基酸提取量为114.77 mg/g，RSD为0.013 mg/g，与预测值115.39 mg/g较为相近，证实了模型的有效性和稳定性，上述提取方法可以用于控制和预测实际提取过程。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.T004表4最佳提取工艺验证试验试验号辣木叶干粉质量/g氨基酸提取量/(mg/g)平均提取量/(mg/g)RSD/%11.002114.7821.004114.7631.002114.79114.771.341.003114.7751.000114.763结论本研究结果表明，4个因素对辣木叶游离氨基酸提取影响依次为：超声时间超声温度乙醇浓度超声功率。通过Design-Expert 8.0软件优化所得到的辣木叶游离氨基酸的最佳工艺条件为：乙醇浓度25%、超声提取时间54 min、超声提取温度45 ℃、超声功率125 W。在此条件下，游离氨基酸提取量可达到114.77 mg/g，与预测值较为相近，证实了模型的有效性，表明优化超声辅助提取辣木叶游离氨基酸的提取工艺具有很好的参考价值和实用价值。