玉米作为我国主要饲料农作物，年产量超过2亿t，其中玉米芯产量超2 000万t[1-2]，被广泛应用于畜牧业。但因玉米芯中纤维素和半纤维素的含量较高[3]，动物无法消化吸收，造成玉米芯资源浪费。因此，对玉米芯进行广泛开发，提高利用率具有重要意义。玉米芯提取物具有抗氧化、抗菌和益生等生物活性功能[4-6]。采用生物法中酶法处理玉米芯，可以破坏玉米芯中纤维素、半纤维素及木质素之间的化学键，使活性成分得到充分的释放[7]。关于玉米芯提取物的提取方式有多种，使用热水浸提法提取玉米芯中活性成分，具有高效、廉价和环保等优势。然而，有关酶解玉米芯水提物其他生理活性如对肠道健康有益作用鲜见报道。体外模拟肠道酵解可以跟踪检测酵解产物形成及酵解过程中生成物含量变化，实现动物体内酵解的动力学检测[8]。体外模拟肠道酵解具有重复性、操作简单、成本低和易操控等优点。因此，本试验采用纤维素酶酶解玉米芯，得到酶解玉米芯水提物，通过体外模拟肠道酵解，对比酶解前后玉米芯水提物对鸡肠道内容物pH值、总糖含量、还原糖含量、短链脂肪酸含量、淀粉酶活性和蛋白酶活性的影响，为玉米芯在饲料业的应用提供参考1材料与方法1.1试验材料玉米芯、玉米、豆粕和麸皮均购自市场。纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、果胶酶均购自夏盛（北京）生物科技开发有限公司。1.2试验方法1.2.1酶解玉米芯的制备将原料按照一定的配比称量（65%玉米芯粉+20%玉米粉+10%豆粕粉+5%麸皮），混匀的原料玉米芯，分别添加不同种类酶，混匀后加入35%的水充分搅拌，pH值为5.0，放入55 ℃培养箱中酶解20 h，对比不同酶对原料的酶解作用及优选酶添加量的筛选。1.2.2玉米芯水提物的营养成分酶解后玉米芯在烘箱内45 ℃烘干，粉碎，原料和酶解玉米芯干料中分别加入水溶解（料水比为1∶10），80 ℃水浴30 min，离心，取上清液，冷冻干燥得到原料和酶解玉米芯水提物。多糖含量测定：采用苯酚-硫酸法[9]，取1 mL样品的上清液，加入1 mL苯酚（6%）、5 mL浓硫酸，摇匀，20 min后测490 nm波长处吸光度。蛋白含量测定：采用CBA试剂盒法测定。木聚糖含量测定：原料和酶解玉米芯水提物各取1 g，按1∶10的比例与水混匀，80 ℃水浴30 min，离心15 min（5 000 r/min）；在1 mL上清液中加入3 mL盐酸，100 ℃水浴2 h，冷却，调pH值至中性，加入蒸馏水至10 mL。取1 mL反应液按1:1比例加入DNS试剂，100 ℃水浴5 min，蒸馏水加至10 mL。取200 μL样品，测定吸光度。1.2.3体外模拟肠道酵解特性采集42日龄健康白羽肉鸡肠道内容物，按1∶10的比例添加磷酸缓冲液，匀浆后离心取上清液备用。将上述上清液分装后分别添加1%酶解前后玉米芯水提物，以蒸馏水为对照组，放入37 ℃恒温水浴摇床中厌氧培养，分别于0、1、6、12 h取样离心，取上清液以下指标测定。1.2.3.1酵解产物pH值的测定取出酵解液离心，采用pH计测定pH值，每组重复3次，数据以“平均值±标准差”表示。1.2.3.2酵解产物总糖含量的测定酵解产物总糖含量采用苯酚-硫酸法测定[9]。1.2.3.3酵解产物还原糖含量的测定酵解产物还原糖含量采用DNS显色法测定[10]。1.2.3.4酵解产物中蛋白酶活性的测定取1 mL上清液，蒸馏水做对照组，37 ℃水浴3~5 min，加入2 mL酪素溶液（5%），反应20 min，加入3 mL三氯乙酸溶液（10%）终止反应，离心15 min（10 000 r/min）。分别取2 mL上清液，加入5 mL碳酸钠溶液（0.55 mol/L）及1 mL福林酚试剂，37 ℃水浴15 min。680 nm波长处测吸光度。1.2.3.5酵解产物中淀粉酶活性的测定取1 mL上清液，使用水做对照组，加入3 mL淀粉溶液（2%），37 ℃水浴锅中反应30 min。加入1 mL氢氧化钠溶液（2 mol/L）终止反应，加入1 mL DNS 溶液，沸水浴5 min，测定540 nm波长处吸光度。1.2.3.6酵解产物中短链脂肪酸含量的测定酵解产物中短链脂肪酸含量使用气质联用仪测定[11]。1.3数据统计与分析采用SAS 9.2数据处理软件进行数据统计分析，结果均以“平均数±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同酶及含量对玉米芯水提得率的影响（见表1、表2）由表1可知，纤维素酶酶解玉米芯水提得率最高，为14.30%，是酶解前的5.72倍。因此，选择纤维素酶用于玉米芯的酶解。由表2可知，随着纤维素酶添加量增加，酶解玉米芯水提得率增加，纤维素酶添加量为1 000 U/g时，水提得率达17.51%。因此，纤维素酶的最佳添加量为1 000 U/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.015.T001表1不同酶对玉米芯水提物得率的影响原料及酶种类水提物得率原料2.50±0.02d纤维素酶14.30±0.13a木聚糖酶7.30±0.04c甘露聚糖酶7.60±0.06c果胶酶9.70±0.09b%10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.015.T002表2纤维素酶添加量对玉米芯水提物得率的影响纤维素酶添加量/(U/g)水提物得率/%02.50±0.02d62.57.70±0.08d125.09.10±0.17d250.011.20±0.13c500.015.50±0.06b1 000.017.50±0.18a2.2酶解玉米芯营养成分分析（见表3）由表3可知，与未酶解的原料玉米芯水提物相比，酶解组玉米芯水提物的多糖、蛋白、木聚糖含量显著提高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.015.T003表3酶解玉米芯营养成分分析组别多糖含量蛋白含量木聚糖含量原料组75.45±2.67b10.66±0.56b56.25±3.24b酶解组183.36±3.99a67.52±2.45a89.58±2.89a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05）；表9与此同。mg/g2.2玉米芯水提物酵解产物对pH值的影响（见表4）由表4可知，各组酵解产物的pH值随着酵解时间的增加均显著降低（P0.05）。发酵1~6 h时，酶解玉米芯水提物酵解产物的pH值显著低于原料玉米芯水提物，且均显著低于对照组。12 h时，原料组和酶解组玉米芯水提物酵解产物pH值达到较低，分别为4.49和4.51。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.015.T004表4玉米芯水提物酵解产物对pH值的影响组别0 h1 h6 h12 h对照组7.48±0.05Aa6.90±0.06Ab6.64±0.04Ac6.45±0.01Ad原料组7.34±0.13Ba6.76±0.04Bb6.25±0.05Bc4.49±0.01Bd酶解组7.32±0.01Ba6.69±0.02Cb5.87±0.04Cc4.51±0.01Bd注：同列数据肩标大写字母不同表示差异显著（P0.05），同行数据肩标小写字母不同表示差异显著（P0.05）；表5~表8与此同。2.3玉米芯水提物酵解产物对总糖含量的影响（见表5）由表5可知，原料组和酶解组玉米芯水提物酵解产物中总糖含量均显著高于对照组（P0.05）。1 h后，随着酵解时间的增加，各组总糖含量显著下降（P0.05），且原料组高于酶解组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.015.T005表5玉米芯水提物酵解产物对总糖含量的影响组别0 h1 h6 h12 h对照组0.97±0.01Bb1.10±0.01Ba0.02±0.00Cc0.01±0.00Cd原料组7.23±0.16Aa6.60±0.03Ab6.50±0.08Ab3.60±0.01Ac酶解组6.50±0.01Aa6.72±0.03Aa3.70±0.01Bb2.50±0.01Bcg/L2.4玉米芯水提物酵解产物对还原糖含量的影响（见表6）由表6可知，原料组、酶解组玉米芯水提物酵解产物中还原糖含量随着酵解时间延长先增加后减少，对照组逐渐减少。1 h后，各组还原糖含量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.015.T006表6玉米芯水提物酵解产物对还原糖含量的影响组别0 h1 h6 h12 h对照组0.62±0.01Ba0.51±0.01Bb0.15±0.03Cc0.02±0.00Cd原料组4.85±0.01Ac5.37±0.02Aa5.11±0.09Ab2.88±0.04Ad酶解组4.63±0.12Aa4.68±0.01Aa3.73±0.04Bb1.93±0.08Bcg/L2.5玉米芯水提物酵解产物对蛋白酶活性的影响（见表7）由表7可知，蛋白酶活性随着酵解时间的延长均显著降低（P0.05）。原料组和酶解组蛋白酶活性在各个时间点均显著高于对照组（P0.05）。在0~6 h时，酶解组蛋白酶活性显著高于原料组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.015.T007表7玉米芯水提物酵解产物对蛋白酶活性的影响组别0 h1 h6 h12 h对照组599.37±0.00Ca525.13±6.84Cb262.57±9.65Cc203.69±6.84Cd原料组682.15±14.88Ba593.97±7.64Bb404.23±17.70Bc289.02±5.23Ad酶解组742.738±20.11Aa626.39±12.47Ab440.36±11.67Ac231.85±0.80BdU/mL2.6玉米芯水提物酵解产物对淀粉酶活性的影响（见表8）由表8可知，在0~1 h，酶解玉米芯水提物酵解产物中的淀粉酶活性显著高于对照组和原料组（P0.05）。在6 h时，原料组和酶解组淀粉酶活性显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.015.T008表8玉米芯水提物酵解产物对淀粉酶活性的影响组别0 h1 h6 h12 h对照组255.87±5.55Ba261.94±4.53Ba162.73±4.35Bb89.62±4.09Ac原料组160.92±5.32Cc232.41±2.93Ca199.74±4.5Ab13.2±2.39Bd酶解组276.86±0.39Ab288.96±1.86Aa196.13±6.32Ac4.71±1.02CdU/mL2.7玉米芯水提物酵解产物对中短链脂肪酸的影响（见表9）由表9可知，酶解玉米芯水提物酵解产物的总短链脂肪酸的含量略高于原料组，但在12 h时显著低于对照组（P0.05）。酵解产物中的短链脂肪酸，含量由低到高依次为：乙酸正丁酸丙酸异丁酸正戊酸异戊酸。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.015.T009表9玉米芯水提物酵解产物对中短链脂肪酸的影响组别发酵时间/h乙酸丙酸异丁酸正丁酸异戊酸正戊酸总短链脂肪酸对照组01.260±0.027d0.300±0.010b0.580±0.001a0.400±0.005a0.010±0.001a0.030±0.000a2.030±0.020c125.270±0.010a0.580±0.008a0.020±0.003b0.200±0.010c0.010±0.001a0.020±0.006a6.090±0.030a原料组00.710±0.014d0.170±0.005c0.010±0.002b0.210±0.002c0.010±0.000a0.010±0.000a1.130±0.021d122.900±0.043c0.170±0.002c0.020±0.003b0.220±0.002b0.010±0.001a0.020±0.000a3.320±0.047b酶解组01.200±0.009d0.150±0.008c0.020±0.004b0.190±0.007c0.010±0.001a0.010±0.000a1.590±0.023d123.510±0.038b0.160±0.007c0.020±0.001b0.190±0.001c0.010±0.001a0.010±0.000a3.900±0.040bmmol/L3讨论本试验通过纤维素酶酶解玉米芯，使用热水浸提法得到玉米芯水提物，水提得率显著增加，多糖含量也显著增加，可能原因是纤维素酶降解了植物细胞壁和细胞膜，减少提取时来自细胞壁、细胞膜和细胞间质的阻力，使有效成分得到释放[12]。多糖在肠道经过各种微生物的酵解及肠道本身微生物的新陈代谢会产生大量的酸性代谢产物[13]，降低肠道的pH值，有利于有益菌的生成，抑制有害菌的增殖，确保动物的肠道健康[14]。本试验发现，各组pH值均达到最低，酶解玉米芯水提物酵解产物的效果较好，可能因为玉米芯酶解释放更多的生物活性物质，被更多的肠道微生物所利用，产生大量H+从而降低pH值。胡婕伦[15]发现，大粒车前子多糖酵解时的pH值在0~24 h从6.1降至5.1，较对照组更低。沈佳琳[16]研究黑果枸杞粗多糖在体外模拟肠道发酵，发现pH值从7.57下降至5.18。酶解玉米芯水提物酵解产物中的总糖含量低于原料，可能是总糖作为肠道微生物酵解底物在后期被分解还原糖。在酵解全期，除对照组，还原糖含量呈现先增加后减少的趋势，这是因为在前期酵解时多糖糖苷键被破坏，产生一些还原糖，还原糖会在酵解过程中被消耗。对照组的还原糖含量持续下降，可能是被微生物持续利用而减少，与张冠亚[17]、任贝贝[18]的研究结果一致。消化酶的活性可以直接影响动物机体的消化代谢功能[19]。本研究中，玉米芯水提物蛋白酶活性均较空白组高，在0~6 h，酶解玉米芯水提物效果最佳。可能因为玉米芯在经过酶解后多糖和蛋白由大分子结构变为机体更易吸收的小分子。0~6 h时，酶解玉米芯酵解产物中的淀粉酶活性高，抑制了淀粉酶活性的降低；在酵解12 h时，原料和酶解玉米芯水提物淀粉酶活性大幅下降，可能因为消化酶最适pH值为中性偏酸性[20]，经过一定时间的酵解后产物呈酸性，导致消化酶活性下降。短链脂肪酸含量反映动物的机体健康状况[21]。本试验中，乙酸是体外模拟肠道酵解产物中含量最丰富的短链脂肪酸，对pH值的变化产生主要影响。可能是酶解玉米芯较原料相比多糖的一些性质如粒径、结构特征、分子量、表面特征、溶解度和黏度发生改变，从而影响酵解过程中短链脂肪酸的产量[15]。本研究中，对照组的酵解产物短链脂肪酸含量高于原料和酶解组，可能在肉仔鸡肠道内容物中的多糖、淀粉等被微生物酵解利用[22]，产生短链脂肪酸，也有可能是酵解时间过短所致。4结论玉米芯经1 000 U/g纤维素酶酶解后，制备得到的提取物较原料玉米芯提取物具有更强的体外模拟肠道酵解特性。随着酵解时间的增加，酵解产物的pH值、总糖含量及蛋白酶活性逐渐降低，还原糖含量出现先增加后降低的趋势，淀粉酶活性在酵解1 h时达到最高。酵解过程中产生的主要短链脂肪酸为乙酸、正丁酸和丙酸。