瘤胃微生物是反刍动物降解、利用饲粮纤维的主要途径[1]。硝酸钠是常见的甲烷抑制剂和非蛋白氮添加剂[2]。在反刍动物饲粮中添加硝酸钠可提高瘤胃氧化还原电位[3]，改变瘤胃微生物结构[4-5]，降低水牛瘤胃微生物数量[6]，影响反刍动物的饲粮利用率。棕榈酸酯包被蛋氨酸是常见的反刍动物蛋氨酸添加剂，瘤胃降解率约30%[7]。蛋氨酸是重要的微生物生长因子，位于蛋白质外部时，可以吸收氧化自由基，改善内环境[8]。瘤胃细菌生长受氨基酸的刺激，虽然机制尚不清楚，但研究发现蛋氨酸具有独特的功能，对瘤胃微生物的生长具有积极影响[9]。全面认识硝酸钠和蛋氨酸对瘤胃微生物及饲粮消化性能的影响，有利于硝酸钠和蛋氨酸在水牛饲粮中普及和使用。本试验从瘤胃微生物结构、饲料消化率及血液生化指标3个方面评价硝酸钠与蛋氨酸联合使用对水牛的影响。1材料与方法1.1试验材料棕榈酸酯包被蛋氨酸购自湖南力莲生物有限公司，蛋氨酸含量为50%。尿素购自广西柳州亿炫化工有限公司，氮含量为46.4%，纯度≥99%。硝酸钠购自杭州双木化工有限公司，氮含量为16.47%，纯度≥99%。1.2试验设计试验选用体重（640±25）kg、产奶量（7.63±0.19）kg的泌乳中期摩拉水牛40头。随机分为4组，每组10个重复。各组添加剂使用量如下：A组（对照）、B组（硝酸钠70 g/d）、C组（蛋氨酸15 g/d）、D组（硝酸钠70 g/d和蛋氨酸15 g/d）。为排除氮含量对试验结果的影响，使用尿素对各组进行等氮处理，添加剂与饲粮混合后分2次饲喂，饲喂时间分别为每天5：30和16：30。试验期42 d，前7 d B、D组的硝酸钠添加量为35 g/d，试验日期为2020年6月~7月。试验水牛日常管理按牛场正常程序进行，基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00啤酒糟50.00泌乳净能/(MJ/kg)5.45玉米叶16.00粗蛋白质/%20.75青贮象草20.00中性洗涤纤维/%50.61玉米3.60酸性洗涤纤维/%21.56豆粕7.10灰分/%5.87麦麸1.00棉粕1.25磷酸氢钙0.10贝壳粉0.10食盐0.15小苏打0.20预混料0.50注：1.每千克预混料提供：VA 500 000 IU、VD 150 000IU、VE 3 000 IU、Fe 40 g、Cu 13 g、Mn 30g 、Zn 60g 、I 80 g、Se 50 g、Co 80 g。2.营养水平中泌乳净能为计算值，其余均为实测值。1.3样本采集与指标测定试验第40、41、42 d，连续3 d采集试验水牛粪样和饲粮样本，在粪样中加入10%硫酸溶液4 mL左右，参照周子成[10]的方法测定饲粮和粪样中的粗蛋白、中兴洗涤纤维、酸性洗涤纤维及酸不溶性灰分表观消化率。养分表观消化率=100-100×(饲粮中酸不溶性灰分含量/饲粮中该养分含量)×(粪便中该养分含量/饲粮中该养分含量)×100%(1)试验第44 d，禁食12 h，空腹采集试验水牛血液，立即送广西壮医医院测定血清甲状腺素水平，使用酶联免疫法测定试验动物血清血红蛋白和高铁血红蛋白含量。试验第45 d，空腹采集水牛瘤胃液，参照郭艳霞等[6]的方法进行瘤胃微生物的定量分析，高通量实时荧光定量核酸扩增引物见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.T002表2高通量实时荧光定量核酸扩增引物种类引物序列（5'-3'）扩增长度/bp总细菌F：GTGSTGCAYGGYYGTCGTCA123R：ACGTCRTCCMCNCCTTCCTC总真菌F：GAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTC120R：CAAATTCACAAAGGGTAGGATGATT原虫F：GCTTTCGWTGGTAGTGTATT223R：CTTGCCCTCYAATCGTWCT产甲烷菌F：TTCGGTGGATCDCARAGRGC130R：GBARGTCGWAWCCGTAGAATCC1.4数据统计与分析数据采用Excel 2010软件进行整理，使用SPSS 21.0统计软件对数据进行单因素方差分析和皮尔逊相关性分析，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1硝酸钠和蛋氨酸对水牛日粮表观消化率的影响（见表3）由表3可知，C组水牛干物质采食量显著低于A组（P0.05），干物质表观消化率较A组显著增加（P0.05），各组水牛的酸性洗涤纤维（ADF）、中性洗涤纤维（NDF）、粗蛋白（CP）表观消化率均无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.T003表3硝酸钠和蛋氨酸对水牛日粮表观消化率的影响项目采食量/(kg/d)中性洗涤纤维/%酸性洗涤纤维/%粗蛋白/%干物质/%P值0.0010.4230.4330.7120.032A组8.44±0.29a61.62±5.6326.08±8.5666.15±3.5072.94±3.26bB组8.35±0.18a58.87±3.8630.22±5.0164.30±3.0671.83±3.65bC组7.73±0.58b59.88±7.4225.18±9.0465.39±4.0678.73±5.94aD组8.17±0.28a62.73±4.2129.38±8.2265.16±3.5376.07±7.96ab注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2硝酸钠和蛋氨酸对水牛瘤胃微生物数量的影响（见表4）由表4可知，各组间水牛瘤胃细菌和原虫浓度无显著差异（P0.05），B组水牛瘤胃甲烷菌浓度显著高于其余各组（P0.05），D组水牛瘤胃真菌浓度显著低于A组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.T004表4硝酸钠和蛋氨酸对水牛瘤胃微生物数量的影响项目细菌/(×1010拷贝数/mL)产甲烷菌/(×107拷贝数/mL)原虫/(×107拷贝数/mL)真菌/(×108拷贝数/mL)P值0.9040.0010.1370.011A组13.05±8.981.51±0.54b3.01±0.538.19±3.07aB组9.93±9.0310.52±5.54a3.31±0.567.74±0.74abC组12.02±8.092.08±1.61b3.17±0.216.03±2.08abD组8.92±0.570.88±0.30b2.67±0.504.22±1.41b2.3硝酸钠和蛋氨酸对水牛血液生化指标的影响（见表5）由表5可知，试验各组水牛的血红蛋白（Hb）、高铁血红蛋白（MHb）含量、血红蛋白/高铁血红蛋白及三碘甲状腺原氨酸、四碘甲状腺原氨酸水平均无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.T005表5硝酸钠和蛋氨酸对水牛血液生化指标的影响项目血红蛋白/(g/L)高铁血红蛋白/(g/L)血红蛋白/高铁血红蛋白/%三碘甲状腺原氨酸/(μg/L)四碘甲状腺原氨酸/(μg/L)P值0.2000.6400.2120.8610.239A组60.39±15.314.93±1.038.34±1.441.22±0.2134.67±14.22B组79.69±13.704.85±1.825.93±1.481.18±0.1744.00±5.77C组84.08±1.865.80±0.346.90±0.261.15±0.2939.19±9.22D组81.01±16.455.80±0.717.30±1.401.25±0.2235.47±7.982.4硝酸钠和蛋氨酸对水牛日粮表观消化率和瘤胃微生物数量的影响（见表6）由表6可知，瘤胃真菌浓度与中性洗涤纤维表观消化率间呈显著正相关（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.T006表6硝酸钠和蛋氨酸对水牛日粮表观消化率和瘤胃微生物数量的影响项目中性洗涤纤维酸性洗涤纤维粗蛋白干物质细菌0.142-0.1420.045-0.207产甲烷菌0.106-0.0130.1500.204原虫0.072-0.232-0.244-0.208真菌0.446*-0.0270.1570.313注：*表示在0.05水平（双侧）上显著相关。3讨论3.1硝酸钠和蛋氨酸对水牛日粮表观消化率的影响王鹏举等[11]研究发现，饲粮中添加蛋氨酸可以提高反刍动物饲粮干物质和有机物的消化率。本试验研究发现，单独添加蛋氨酸会降低水牛采食量，增加干物质表观消化率。燕磊[12]研究发现，在饲粮中添加蛋氨酸对中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维及干物质表观消化率无显著影响，日粮组成的不同造成试验结果差异。路佩瑶等[13]研究发现，瘤胃微生物未适应硝酸钠时，硝酸钠会降低饲草动物对干物质消化率，适应后，硝酸钠则不会影响干物质消化率。本试验持续42 d，发现硝酸钠不影响水牛消化率。3.2硝酸钠和蛋氨酸对水牛瘤胃微生物数量的影响Zhao等[14]研究发现，反刍动物饲粮中添加硝酸钠不会影响瘤胃细菌数量，可以增加瘤胃原虫和瘤胃真菌数量。本试验研究发现，硝酸钠和蛋氨酸对水牛瘤胃细菌、原虫含量无影响。郭艳霞等[6]通过体外发酵试验，探究硝酸钠与延胡索酸联合使用对瘤胃微生物的影响，发现提高硝酸钠添加比例后，瘤胃中细菌、真菌、产甲烷菌及原虫数量显著降低。本试验研究发现，水牛日粮单独添加硝酸钠后，水牛瘤胃甲烷菌数量增加，硝酸钠与蛋氨酸联合使用可以降低水牛瘤胃真菌数量。3.3硝酸钠和蛋氨酸对水牛血液生化指标的影响硝酸钠代谢产物亚硝酸钠会造成动物急性亚硝酸钠中毒。Yang等[15]认为，当动物血清高铁血红蛋白占血红蛋白的20%时，动物可能会缺氧。当血清高铁血红蛋白占血红蛋白的35%时，动物可能发生肝损伤[16]。本试验研究发现，试验水牛血清高铁血红蛋白与血红蛋白比值远低于20%，说明70 g/d硝酸钠不会影响试验动物健康，各组间甲状腺素也未出现明显差异。3.4日粮表观消化率和瘤胃微生物数量的相关分析日粮消化是连续有机的过程，日粮纤维及纤维素结合蛋白主要通过瘤胃微生物水解，进而被动物吸收利用。薛丰[17]认为，瘤胃微生物种类、数量及饲粮种类都会影响微生物对饲粮的降解。研究表明，瘤胃真菌在消化大颗粒、大片段、植物纤维饲粮过程中至关重要[1]。本试验研究发现，日粮中性洗涤纤维的表观消化率与瘤胃真菌数量间呈显著正相关。4结论水牛日粮中添加蛋氨酸不会影响瘤胃微生物结构，可以降低水牛采食量，提高水牛饲粮表观消化率。水牛日粮中添加硝酸钠可以增加瘤胃产甲烷菌数量，日粮消化率不变，不影响水牛健康。蛋氨酸与硝酸钠联合使用可以降低瘤胃真菌数量，日粮消化性能不受影响。瘤胃真菌数量与中性洗涤纤维消化率呈正相关。