动物机体氧化还原平衡是维持机体各器官正常运转的前提。研究表明，氧化应激会导致蛋白质变性、脂质氧化和肝肠功能受损等问题[1]。随着畜牧业的发展，抗生素所带来的副作用日益受到关注。因此，开发和筛选抗生素替代品成为研究热点。乳酸菌在畜禽养殖中应用广泛，具有促进畜禽生长、改善肠道健康及增强免疫力等作用[2-3]。Wang等[4]研究表明，在饲粮中添加乳酸菌能调节肠道菌群，预防和治疗机体炎症，提高抗氧化水平。Chen等[5]报道，德氏乳杆菌对改善仔猪的抗氧化状态具有积极作用。本试验在前期经大规模筛选，从健康家兔消化道分离出1株抗逆和产酸特性较强的乳酸片球菌Pediococcus acidlatictici LC-6-2，本试验对该菌抗氧化特性进行探究。LPS作为革兰氏阴性菌膜的结构物质，不仅能诱导产生大量的自由基，还能导致机体发生氧化应激反应，常应用于模拟动物的氧化应激。因此，本试验中，肉兔腹腔2次注射LPS诱导氧化应激模型，探究在应激情况下，乳酸片球菌对肉兔血清、肝脏和肠黏膜抗氧化力的缓解作用，为乳酸片球菌的应用提供参考。1材料与方法1.1试验日粮及材料试验基础饲粮组成及营养水平参照美国NRC（1997）兔营养需求推荐量[6]以及谷子林[7]建议的家兔营养需要进行设计和配制，压制成长10 mm、直径4 mm颗粒。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.013.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米16.50消化能/(MJ/kg)9.20麸皮10.00干物质/%89.01豆粕16.00粗蛋白/%17.14苜蓿草粉26.00粗脂肪/%3.21燕麦草粉27.50粗纤维/%13.99食盐0.50中性洗涤纤维/%35.24赖氨酸0.08酸性洗涤纤维/%17.30蛋氨酸0.12石粉1.00预混料0.30棕榈油粉0.50膨润土1.50注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 10 000 IU、VD 900 IU、VE 50 mg、VK 2 mg、VB12 0.02 mg、硫胺素2 mg、核黄素6 mg、泛酸50 mg、吡哆醇2 mg、烟酸50 mg、胆碱1 000 mg、生物素0.2 mg、铁70 mg、铜20 mg、锰10 mg、硒0.25 mg、钴0.15 mg、碘0.2 mg。2.营养水平中消化能为计算值，其余均为实测值。乳酸菌液：Pediococcus acidlatictici LC-6-2由本实验室保藏，调整终浓度为（5×106 CFU/g）。大肠杆菌脂多糖（LPS）：大肠杆菌血清型O55∶B5，市购。使用时，用0.9%的生理盐水稀释成浓度为100 mg/L的LPS溶液。1.2试验动物与设计试验于河北农业大学试验基地进行。选取体重相近的42日龄新西兰肉兔72只（公、母各半），随机分为3组，每组6个重复，每个重复4只。单笼饲养，自由饮水和光照。预试期7 d，正式试验期35 d。CON组和LPS组均饲喂基础饲粮，LPS+PA组饲喂基础日粮+5×106 CFU/g乳酸片球菌LC-6-2。LPS、LPS+PA组分别在第28 d和31 d，每个重复选取1只体重相近的家兔，按200 μg/kg BW剂量腹腔注射LPS，CON组注射等量0.9%生理盐水，第35 d麻醉、屠宰。1.3样品采集1.3.1血样采集试验结束后，对试验兔前腔静脉采血，收集于抗凝管中静置15 min，3 000 r/min离心10 min，-20 ℃保存备用。1.3.2组织样采集试验结束后，屠宰试验兔，取肝脏一块放置于冻存管中；截取回肠约10 cm的肠段，用生理盐水清洗干净后，在冰盘上用载玻片迅速刮取黏膜装于离心管中，然后将肝脏和回肠黏膜样品放置在-80 ℃冰箱冻存。1.4测定指标及方法1.4.1血清生化指标生化指标包括超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、二胺氧化酶（DAO），试剂盒均购于南京建成生物工程研究所，测定仪器为SpectraMAX Plus-384酶标仪。1.4.2肝脏和回肠黏膜抗氧化指标肝脏和回肠黏膜抗氧化指标包括SOD、MDA、CAT，试剂盒均购于南京建成生物工程研究所，测定仪器为SpectraMAX Plus-384酶标仪。1.5数据统计与分析数据采用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1兔源乳酸片球菌LC-6-2对脂多糖刺激肉兔血清抗氧化指标的影响（见表2）由表2可知，与CON组相比，LPS组肉兔血清SOD活性降低1.48%（P0.05），LPS+PA组肉兔血清SOD活性提高0.53%（P0.05）。LPS组、LPS+PA组肉兔血清CAT活性较CON组分别降低28.37%、7.80%（P0.05）。与CON组相比，LPS组肉兔血清MDA含量极显著升高27.35%（P0.01），LPS+PA组肉兔血清MDA含量显著降低16.88%（P0.05）；LPS组、LPS+PA组肉兔血清DAO活性较CON组分别提高3.28%（P0.05）和1.72%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.013.T002表2兔源乳酸片球菌LC-6-2对脂多糖刺激肉兔血清抗氧化指标的影响组别SOD/(U/mL)MDA/(μmol/L)CAT/(U/mL)DAO/(U/mL)CON组58.92±5.644.68±0.54Bb1.41±0.33329.13±6.75bLPS组58.05±5.265.96±0.93Aa1.01±0.34339.94±6.51aLPS+PA组59.23±4.683.89±0.93Bc1.30±0.34334.78±7.32ab注：同列数据肩标不同小写字母表示差异性显著（P0.05）；相同小写字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；大写字母不同表示差异极显著（P0.01）；下表同2.2兔源乳酸片球菌LC-6-2对脂多糖刺激肉兔肝脏抗氧化指标的影响（见表3）由表3可知，与CON组相比，LPS组、LPS+PA组肝脏SOD活性分别降低22.21%（P0.01）和15.84%（P0.05）。与CON组相比，LPS组肉兔肝脏MDA含量升高33.33%（P0.05），LPS+PA组肉兔肝脏MDA含量降低3.03%（P0.05）。与CON组相比，LPS组、LPS+PA组肉兔肝脏CAT活性分别提高33.33%（P0.05）、72.22%（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.013.T003表3兔源乳酸片球菌LC-6-2对脂多糖刺激肉兔肝脏抗氧化指标的影响组别SOD/(U/mg prot)MDA/(μmol/g prot)CAT/(U/mg prot)CON组10.04±0.98Aa0.33±0.05ab0.36±0.05BbLPS组7.81±0.87Bb0.44±0.12a0.48±0.10ABaLPS+PA组8.45±0.55ABb0.32±0.06b0.65±0.06Aa2.3兔源乳酸片球菌LC-6-2对脂多糖刺激肉兔肠黏膜抗氧化指标的影响（见表4）由表4可知，与CON组相比，LPS组肉兔肠黏膜SOD活性显著降低18.32%（P0.05），LPS+PA组肉兔肠黏膜SOD活性提高3.14%（P0.05）。与CON组相比，LPS+PA组肉兔肠黏膜MDA含量降低，但差异不显著（P0.05）。与CON组相比，LPS组和LPS+PA组肉兔肠黏膜CAT活性降低，但差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.013.T004表4兔源乳酸片球菌LC-6-2对脂多糖刺激肉兔肠黏膜抗氧化指标的影响组别SOD/(U/mg prot)MDA/(μmol/g prot)CAT/(U/mg prot)CON组7.97±0.56a0.27±0.061.80±0.12LPS组6.51±1.05b0.27±0.041.32±0.24LPS+PA组8.22±0.51a0.25±0.031.69±0.553讨论DAO是哺乳动物小肠黏膜上层绒毛中具有高度活性的细胞内酶，反映肠道机械屏障的完整性和受损程度。研究表明，LPS应激会导致肠黏膜组织受损，引起血清中DAO活性上升，进而引起畜禽机体出现炎症反应[8]。本试验结果表明，与CON组和PA+LPS组比较，LPS组血清中DAO活性显著提高。本试验结果与黎佳颖等[9]对断奶仔猪饲喂大肠杆菌导致血清中DAO活性显著高于对照组的试验结果一致；与Lei等[10]报道的在蛋鸡日粮中添加地衣芽孢杆菌能够显著降低血浆中DAO活性的结果也一致。该结果表明，日粮中添加乳酸菌能有效缓解LPS应激导致的肠黏膜损伤。肠黏膜损伤与MAPKs信号通路有关，且p38 MAPK是MAPKs信号通路的重要一员。肠黏膜受损时，p38 MAPK信号通路被激活，调节与炎症相关的因子，对受损组织进行修复[11]。造成本试验结果可能是机体受到LPS应激时，乳酸片球菌可以激活MAPKs信号通路，诱导炎症因子基因表达量上调，从而缓解肠黏膜损伤，降低DAO活性。LPS会诱导动物机体产生大量ROS，破坏机体的氧化物生成系统和抗氧化系统的平衡状态，引起机体抗氧化能力下降。线粒体呼吸链复合体可利用电子传递产生三磷酸腺苷（ATP），是ROS的主要来源[12-13]，机体可通过抗氧化酶来清除过量ROS，其中抗氧化酶系统主要包括SOD、CAT等。试验结果表明，与CON组相比，单纯LPS攻毒组在血清、肝脏、肠黏膜中SOD、CAT活性均降低，在日粮中添加乳酸片球菌可以显著提高二者活性，与Linke等[14]、张杰[15]、Zhao等[16]的试验结果一致。MDA含量是反映机体氧化功能损伤情况的重要指标[17]。Li等[18]研究表明，芽孢杆菌能改善LPS应激引起的肉鸡肠道MDA含量上升。Chen等[5]在肉鸡受LPS应激后，观察肝脏MDA含量变化，发现MDA含量升高显著。陈振强[19]究表明，在日粮中添加屎肠球菌能降低肝脏中MDA含量，与本试验研究结果一致。以上研究均表明，LPS会降低机体的抗氧化能力，乳酸菌可以缓解氧化应激损伤。造成这一结果的原因是乳酸菌通过合成SOD，产生氢化氧化酶，清除过量的ROS防御氧化应激对机体损伤[20]。Nrf2是调节基因表达转录的重要转录因子，轻度氧化应激促进Keap 1的泛素化，使Nrf 2解偶联、Keap 1被降解，Nrf 2磷酸化转移到细胞核上，并结合抗氧化反应靶基因的启动子，诱导细胞氧化应激转录。当机体内ROS过多时会导致Nrf 2活化障碍，乳酸片球菌能上调Nrf 2表达，从而缓解氧化应激效果[21]。4结论LPS应激会造成家兔氧化应激、抗氧化能力下降。饲粮中添加乳酸片球菌LC-6-2，能够增强LPS应激下肉兔的肝脏和肠黏膜抗氧化能力，提高血清中抗氧化酶的活性。