细菌素是细菌分泌的小分子多肽或蛋白质，是天然无毒害的抑菌物质[1-2]。产生细菌素菌株主要源自乳酸菌。乳酸菌在发酵中利用原料中的糖生成乳酸、过氧化氢、双乙酰、细菌素和其他有机酸等产物。细菌素可以有效抑制腐败细菌生长[3]。乳酸菌发酵产物对动物肠道的微生物菌群起到调节和保护作用。服用抗生素可以显著改变宿主肠道菌群组成[4]，长期使用抗生素会导致肠道菌群紊乱以及耐药菌株基因长期存在于肠道中[5]。目前，已从各种途径分离到大量产细菌素乳酸菌株。细菌素作为饲料添加剂在单独应用时的抗菌谱、抗菌效价、稳定性等方面存在提升空间。因此，进一步深入开发新型的细菌素满足饲料添加剂发展需求具有重要意义。本研究从内蒙古多处牛、羊肠道中采集的样品中分离到1株产细菌素菌株发酵乳酸菌，通过乳酸菌发酵，在分离纯化得到单一组分细菌素基础上，进一步研究细菌素分子特性及抑菌相关性能，为细菌素在饲料添加剂中开发应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料与仪器样品：从内蒙古牛、羊肠道分离产生细菌素的乳酸菌株N8603。强毒沙门氏杆菌C79-14、强毒鸡白痢杆菌C79-20、强毒大肠杆菌44365、腐生葡萄球菌N9084、蜡样芽孢杆菌N9325、巴氏酵母N9006、双歧杆菌N9404、双歧杆菌N9502、长双歧杆菌动物新亚种N8811、长双歧杆菌N9095、长双歧杆菌N9208、长双歧杆菌N9107、发酵乳杆菌N9198、德氏乳杆菌N9167、贝氏酵母N9308、肠道致病性大肠杆菌N82-86，由内蒙古农牧业科学院动医所提供。乳酸菌筛选培养基为番茄液体培养基，每升培养基中加入：水解乳蛋白10 g、蛋白栋10 g、酵母浸粉5 g、葡萄糖5 g、NaCl 3 g、微量盐1 mL、去离子水800 mL、番茄汁200 mL，使用5 mol/L NaOH调节pH值至7.0，15 psi （103 425 Pa）蒸汽灭菌20 min；培养各细菌指示菌使用LB培养基。牛血清白蛋白粉末购自华美生物工程公司；考马斯亮蓝G-250、蛋白质Marker、四甲基乙二胺（TEMED）、十二烷基硫酸钠（SDS）、Sephadex-G100购自生工生物工程(上海)股份有限公司，进口分装；胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、α-淀粉酶购自北京奥博星生物技术责任有限公司；其他试剂均为国产分析纯。BSI-160A自动部分收集器（上海精科实业有限公司）、GJ-21冷冻高速离心机（美国贝克曼公司）、UV 2100型分光光度计（日本岛津公司）、TY-80B脱色摇床（南京大学）、SL-2型层析实验冷柜（北京博一康实验仪器有限公司）、0.22 μm Millipre滤膜（美国MILLIPORE公司）、HD-21-88核酸蛋白质检测仪（上海琪特分析仪器有限公司）。1.2试验方法1.2.1抑菌活性测定方法采用琼脂扩散试验法：将灭菌后的LB培养基倒入已灭菌的培养皿中，制成平板，待培养基凝固后，取指示菌液0.1 mL置于平板上，使用推棒涂布均匀。平板上打直径为6 mm的孔，一孔为对照组，其余几孔加待测样品。每孔加0.050 mL。培养皿37 ℃培养24 h。观察抑菌圈的大小，以抑菌圈直径的平均值作为评价待测样品的抗菌性能的依据。利用游标卡尺每隔一定的角度测量5次，取平均值。每个样品做3个重复[6-7]。1.2.2乳酸菌的部分生物学特性研究从内蒙古的牛、羊肠道分离的50株乳酸菌中选出最佳的1株乳酸菌：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）N8603进行部分生物学特性研究。菌落外观在显微镜下45°折光观察，在有氧培养、无氧培养、不同的培养温度以及对不同碳水化合物的发酵情况进行初步的鉴定。1.2.3与其他肠道正常菌及与致病菌之间的生长拮抗关系采用“Halo”方法对其他肠道正常菌及对致病菌进行抑菌测定。1.2.4在不同酸碱环境下的生长情况在不同的pH值条件下的番茄液体培养基中培养12 h，采用平板菌落计数法[8]检测培养液中的细菌量。1.2.5发酵特性的初步研究2 h试验菌种子液以1%的接种量接种于250 mL液体番茄培养基中，37 ℃厌氧发酵24 h，每隔2 h取发酵培养液，以未接种的培养液作为空白对照，测定OD600 nm和pH值。同时，4 ℃、3 000 r/min离心30 min，取上清，采用“Halo”方法测定其抑菌圈直径（mm），指示菌为大肠杆菌。培养至最佳发酵时间，离心取上清液，使用1.0 mol/L NaOH中和至pH值5.0，采用“Halo”方法测定其抑菌圈直径（mm），指示菌为大肠杆菌。利用pH值5.0的乳酸作为对照。将发酵4、8、12、14、16、18、20、22、24 h的菌液，离心取上清。采用过氧化氢酶法进行过氧化氢产生的检测。1.2.6细菌素的纯化将乳酸菌N8603接种于液体番茄培养基中，于37 ℃恒温箱静置厌氧培养至最佳时间，于4 ℃、3 000 r/min离心30 min，将上清液与菌体分离，菌体镜检后灭菌弃去，上清液使用1.0 mol/L NaOH调至pH值6.0，0.22 μm微孔过滤膜过滤，采用Bradford检测法[9]对过滤后的上清液进行蛋白质含量的测定。缓慢向上述过滤后的上清液加入研磨后的硫酸铵分别达到10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%饱和度。4 ℃沉淀过夜。收集沉淀，每次所得的沉淀用50 mmol/L的磷酸钠缓冲液溶解，磷酸钠缓冲液的用量是发酵液的1/10。采用“Halo”方法检测盐析上清液与沉淀物水溶液对大肠杆菌的抑菌活性，确定最佳硫酸铵饱和度，并对此条件下盐析的沉淀物水溶液进行蛋白质含量的测定（Bradford 检测法）。在2 % NaHCO3和l mmol/L EDTA（pH值8.0）中煮沸10 min，使用蒸馏水彻底清洗透析袋，放入l mmol/L EDTA（pH值8.0）中煮沸10 min，冷却，4 ℃备用，用前再使用蒸馏水清洗。将上述硫酸铵盐析的淀物的水溶液，1.0 kDa透析袋、4 ℃透析24 h。样品液与透析液体积之比为1∶20，利用10% BaCl2溶液检查透析是否完全，无白色沉淀产生说明透析已经完全。采用Bradford检测法对透析袋内溶液进行蛋白质含量的测定。采用“Halo”方法测定透析袋内溶液中抗菌活性，指示菌为大肠杆菌。透析后得到的产物称为细菌素粗提液。将透析后的细菌素粗提液放在1.0 kDa透析袋中。表面覆盖蔗糖，4 ℃浓缩1 h。以上操作过程要在低温下缓慢进行。蔗糖浓缩后得到的产物称为细菌素浓缩液。流速0.8 mL/min装柱，当胶装到所需高度时，利用300~500 mL、pH值6.0、50 mmol/L的磷酸钠缓冲液充分平衡。将细菌素浓缩液3 mL上样（上样前，样品以5 000 r/min、4 ℃离心10 min，以除去干扰层析的残渣）。待样品的液面降至与胶面相切时，使用1~3 mL的平衡缓冲液将粘在柱子内壁上的残余样品洗下来，流入胶内，重复2~3次，利用平衡缓冲液洗脱，平衡缓冲液流速为1.0 mL/min，收集不同洗脱峰的组分。采用“Halo”方法测定各管收集液的抗菌活性测定，指示菌为大肠杆菌，并对OD600 nm值最高的收集液（管）采用Bradford检测法进行蛋白质含量的测定。对上述硫酸铵盐析沉淀物水溶液和凝胶柱过滤峰值液进行SDS-PAGE电泳。样品处理液与样品按1∶4的比例混合，沸水浴中加热3~5 min。1.2.7细菌素粗提液的理化性质检测分别取l mL细菌素粗提液于5个试管中，分别在37、60、80 ℃处理l h，100 ℃下处理30 min，121 ℃处理15 min。冷却至室温后，采用“Halo”方法测定其抑菌圈直径（mm），指示菌为大肠杆菌，以未经处理的细菌素粗提液做对照。在12个试管中各加入细菌素粗提液l mL，利用0.l mol/L氢氧化钠或0.l mol/L盐酸将样品溶液调节pH值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13，室温保持24 h，将各管pH值调回至约7.0，采用“Halo”方法测定其抑菌圈直径（mm），指示菌为大肠杆菌。在试管中各加入细菌素粗提液l mL，分别经蛋白酶K（37 ℃、pH值7）、胰蛋白酶（30 ℃、pH值7）、胃蛋白酶（37 ℃、pH值7）和α-淀粉酶处理6 h，最终酶浓度为l g/L。采用“Halo”方法测定其抑菌圈直径（mm），指示菌为大肠杆菌，以未处理的细菌素粗提液为对照。2结果与分析2.1乳酸菌N8603的部分生物学特性研究2.1.1乳酸菌N8603培养及生化特性乳酸菌N8603的革兰氏染色见图1。由图1可知，为革兰氏阳性杆菌，大小（0.7~1.0）×（2~4） μm，呈单个或双链排列。N8603在番茄固体培养基上呈乳白色、半透明、表面粗糙。显微镜下45°折光观察，发光均匀、有彩色光带，兼性厌氧。N8603在15 ℃以下和45 ℃以上不生长，能发酵葡萄糖、阿拉伯糖、麦芽糖、核糖和松三糖。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.016.F001图1乳酸菌N8603的革兰氏染色2.1.2乳酸菌N8603与其他肠道正常菌及与致病菌之间的生长拮抗关系N8603抑菌试验结果见表1。由表1可知，对主要肠道致病菌的抑菌直径为19~35 mm，对肠道的其他正常微生物无明显的抑制作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.016.T001表1N8603抑菌试验结果指示菌N8603的抑菌直径/mm肠道致病性大肠杆菌35强毒沙门氏杆菌28强毒鸡白痢杆菌23强毒大肠杆菌19腐生葡萄球菌35蜡样芽孢杆菌35巴氏酵母352.1.3乳酸菌N8603在不同pH值下的生长情况（见表2）由表2可知，乳酸菌N8603在pH值4.2~9.2情况下可以正常生长。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.016.T002表2乳酸菌N8603在不同pH值下的生长情况pH值N86034.0－4.2＋4.4＋4.6＋4.8＋5.0＋5.2＋5.4＋5.6＋5.8＋6.0＋6.2＋6.4＋6.6＋6.8＋7.0＋7.2＋7.4＋7.6＋7.8＋8.0＋8.2＋8.4＋8.6＋8.8＋9.0＋9.2＋9.4－9.6－9.8－10.0－注：“－”表示在该pH值下不能生长；“＋”表示在该pH值下可以生长。2.2乳酸菌N8603发酵特性的初步研究2.2.1抑菌活性的动力学（见图2）由图2可知，培养物pH值随培养时间增长逐渐降低，OD600 nm值随着培养时间的增长而增大。0~8 h时，菌浓度呈指数式增长；8 h后，细菌浓度增长速度缓慢。细菌素的抑菌活性随着培养时间的改变情况类似于菌浓度OD600 nm值的变化情况，随培养时间的增长而增长，20 h时趋于稳定，达最大值。图2N8603的发酵动力学10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.016.F2a1（a）pH值与抑菌直径的变化曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.016.F2a2（b）OD600 nm与抑菌直径的变化曲线2.2.2酸性末端产物作用酸性末端产物作用的检测试验结果见图3。由图3可知，培养物上清液有明显的抑制作用，而乳酸对大肠杆菌无抑制效果。结果表明，发酵过程中产生的有机酸对大肠杆菌无抑制作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.016.F003图3酸性末端产物作用的检测试验结果注：1为乳酸；2为N8603。2.2.3过氧化氢的检测在发酵过程中，N8603培养物上清液均无红色醌式染料形成，表明上清液中过氧化氢的含量较少或者无过氧化氢，排除过氧化氢对指示菌的抑制作用。2.3细菌素的纯化2.3.1细菌增殖及离心去菌上清液的蛋白含量细菌增殖及离心去菌上清液的蛋白含量为：N8603 415.7 μg/g。2.3.2硫酸铵盐析结果在(NH4)2SO4饱和度为30%~40%时，沉淀很少，检测不到抑菌活性。当(NH4)2SO4饱和度为70%时，盐析上清液中残存的抑菌活性物质很少，几乎完全被沉淀下来，沉淀物水溶液的抑菌直径达最大，为此选定饱和度为70%硫酸铵进行盐析。70% (NH4)2SO4饱和度盐析沉淀物水溶液的蛋白含量分别为：N8603 248.3 μg/g。2.3.3硫酸铵盐析沉淀物的透析结果将饱和度为70% (NH4)2SO4盐析沉淀物的水溶液透析后，测定透析袋内液的抑菌活性，其抑菌活性不变；测定透析袋外液的抑菌活性，无抑菌活性。透析袋内液蛋白含量为：N8603 90.25 μg/g。2.3.4细菌素浓缩液的凝胶柱过滤结果凝胶柱过滤结果发现，N8603在洗脱30~50 min时出现1个峰值，抑菌活性测定结果显示，位于这一峰值处的20管收集液抑菌活性最高。Bradford蛋白质含量的测定结果显示，位于峰值处中央的第35管收集液的蛋白含量为7.328 μg/g。2.3.5SDS-PAGE分析（见图4）由图4可知，(NH4)2SO4盐析沉淀物水溶液和凝胶柱过滤峰值液进行SDS-PAGE电泳（15%的分离胶，恒压；120 V、考马斯亮蓝染色），N8603的硫酸铵盐析沉淀物水溶液和凝胶柱过滤峰值液均出现一条带，与蛋白质Marker比较，分子量为35 kDa。(NH4)2SO4盐析沉淀物水溶液的电泳带宽且重，说明蛋白纯度低但浓度高，凝胶柱过滤峰值液的电泳带窄且轻，说明蛋白纯度高但浓度低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.016.F004图4SDS-PAGE分析注：M为Marker；1、2为硫酸铵盐析沉淀物水溶液；3、4为凝胶柱过滤峰值液。2.4细菌素粗提液的理化性质2.4.1细菌素粗提液的热稳定性（见图5）由图5可知，N8603的细菌素粗提液均表现出良好的热稳定性，在80 ℃、30 min的热处理条件下活性基本不变。随着温度的继续升高，抑菌活性呈下降趋势。100 ℃处理30 min后细菌素粗提液均具有一定的抑菌活性，N8603的细菌素粗提液在121 ℃处理后，完全失去抑菌活性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.016.F005图5细菌素粗提液的热稳定性注：1为121 ℃、2为37 ℃、3为60 ℃、4为80 ℃、5为100 ℃。2.4.2细菌素粗提液的酸碱稳定性（见图6）由图6可知，N8603的细菌素粗提液在pH值2~13时，对大肠杆菌均有抑菌活性。pH值2~8时，均显示很强的抑菌活性。pH值为2和3时，可以保持较高的活性，说明N8603产生的细菌素在酸性条件下也有较强的抑菌活性。pH值为6和7时，N8603的细菌素粗提液仍具有抑菌活力，说明产生的细菌素在中性条件下比较稳定。pH值继续升高时，N8603细菌素粗提液的抑菌活力呈明显的下降趋势。pH值为13时，仍然保持一定的抑菌活性，说明N8603细菌素粗提液在碱性条件下也比较稳定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.016.F006图6细菌素粗提液的酸碱稳定性2.4.3细菌素粗提液对酶的稳定性（见图7）由图7可知，1 g/L的а-淀粉酶不能使N8603的细菌素粗提液失去抑菌活性，说明N8603乳酸菌产生的细菌素粗提液中没有起抑菌作用的碳水化合物。胃蛋白酶和胰蛋白酶均可以使N8603细菌素粗提液失活，胰蛋白酶可以使N8603细菌素完全失活。试验表明，N8603产生的细菌素粗提液是蛋白类物质。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.016.F007图7细菌素粗提液对酶的稳定性注：1为胰蛋白酶；2为胃蛋白酶；3为а-淀粉酶；4为胃蛋白酶。3讨论生物添加剂替代传统添加剂是饲料添加剂研究的趋势。Nisin等细菌素在食品防腐剂上被大量应用。在饲料中停止添加抗生素促生长剂后，益生菌、细菌素等生物添加剂必将是未来饲料添加剂发展的重要组成部分。目前，健康动物肠道中微生物菌群成为筛选乳酸菌的1个渠道。有研究人员从鸡鸭粪便[10]、畜禽肠道[11]分离筛选产细菌素的乳酸菌。目前发现的乳酸菌存在的普遍问题是抑菌谱窄、不稳定、分离纯化回收率低。Plantaricin 35d[12]、ST28MS[13]、paracin[14]和Bac TN365[15]等都存在上述缺陷。4结论本研究从健康动物肠道中分离得到产细菌素的乳酸菌N8603。N8603的发酵液经过酸性末端产物作用的检测和过氧化氢的检测，证明发酵上清液具有明显的抑菌特性。N8603对肠道的主要病原菌均有很好的抑菌效果。本试验采用传统的蛋白质纯化手段，纯化的回收率较低，有待进一步研究优化。N8603产的细菌素具有较强的热稳定性，采用蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶处理，抑菌活性会出现明显的降低。确定N8603产生的抑菌物质是蛋白质类物质或者是具有蛋白质成分。试验表明，N8603抑菌效果明显，有望成为饲料添加剂商业开发的备选菌株。