鹌鹑养殖业中，大量使用抗生素会造成菌株耐药性提高，鹌鹑蛋等禽类副产品出现药物残留。因此，迫切需要寻找1种绿色安全无污染的抗生素替代品。抗菌肽（AMPs）是机体先天性免疫系统的重要小肽类物质，广泛存在于自然界生物体中，可以有效改善畜禽生长性能，增强免疫力[1-3]。目前，抗菌肽数据库（APD）中已有2 961种抗菌肽，其中已分离的蝇类抗菌肽多达40种[4]。蝇蛆抗菌肽具有抗菌活性高、抗菌谱广、绿色安全、无残留等优点[5]，现已广泛应用于猪、鸡以及鱼类等研究中，但尚未发现在鹌鹑中应用。因此，本试验拟在黄羽鹌鹑日粮中添加不同水平蝇蛆抗菌肽，研究对鹌鹑血液免疫指标、肠道菌群和免疫器官指数影响，确定其在日粮中的适宜添加量，为蝇蛆抗菌肽替换抗生素应用于鹌鹑养殖业提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验所用蝇蛆虫源由石河子大学农学院昆虫生态资源研究室提供。黄羽鹌鹑购自石河子142团华玉鹌鹑养殖场。鹌鹑饲粮购自新疆天康饲料科技有限公司。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.011.T001表1基础日粮组成及营养水平（干物质基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米52.30代谢能/(MJ/kg)11.95豆粕39.20粗蛋白质/%23.74进口鱼粉2.50钙/%0.81石粉1.25有效磷/%0.32磷酸氢钙0.80赖氨酸/%1.28食盐0.30蛋氨酸/%0.50油脂2.50半胱氨酸/%0.33蛋氨酸0.12赖氨酸0.03预混料1.00注：每千克预混料可提供：VA 330 000 IU、VD 390 000 IU、VE 2 500 IU、VK 100 mg、VB1 200 mg、VB2 400 mg、烟酸 4 000 mg、VB6 300 mg、叶酸 100 mg、泛酸1 500 mg、胆碱 2 000 mg、铁 12 000 mg、铜 500 mg、锰 5 000 mg、硒 20 mg、碘 30 mg。1.2试验设计选用250只1日龄健康、体重相近的黄羽鹌鹑，随机分为5组，每组5个重复，每个重复10只，试验分组及处理见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.011.T002表2试验分组及处理组别数量/只试验处理对照组50基础日粮抗菌肽Ⅰ组50基础日粮+100 mg/kg蝇蛆抗菌肽抗菌肽Ⅱ组50基础日粮+200 mg/kg蝇蛆抗菌肽抗菌肽Ⅲ组50基础日粮+300 mg/kg蝇蛆抗菌肽蝇蛆活体组50与提取300 mg/kg抗菌肽所用重量保持一致试验鹌鹑饲养于石河子大学试验站。所有试验均在同一鹌鹑舍（250 W保温灯提供取暖）进行，鹌鹑自由饮水，每天喂料2次，时间分别为10：00和20：00。试验期42 d。其他免疫和消毒措施严格遵照养殖场程序进行。1.3制备蝇蛆抗菌肽参考Wang等[6]方法制备蝇蛆抗菌肽并进行纯化，分别利用考马斯亮蓝法和微量肉汤稀释法测得提取液浓度为23.19 mg/L，最小抑菌浓度（MIC）为2.0 mg/L，与本研究课题小组结果相近。同时，本研究采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、耐酸性、热稳定性试验等方法，综合确定所分离抗菌活性物质为蝇蛆抗菌肽。1.4测定指标及方法1.4.1血液免疫指标饲喂第42 d，每个重复中随机选取5只鹌鹑，翅下采血2 mL/只，分离血清，-20 ℃冰柜中保存，用于测定黄羽鹌鹑血液免疫指标。血清球蛋白α1、α2、β、γ球蛋白浓度的测定采用醋酸纤维素薄膜电泳法。免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）和补体C3、C4的测定采用酶联免疫法，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。1.4.2盲肠肠道菌群数量饲喂第42 d，每个重复随机选取5只鹌鹑屠宰，无菌操作台内称取1 g盲肠内容物于EP管中，加入已灭菌生理盐水混合均匀，依次10倍递减稀释至1×10-7，按照预试验选择的稀释度，分别取40 μL稀释液接种至伊红美蓝培养基和SS培养基进行大肠杆菌和沙门杆菌培养；分别取40 μL 稀释液接种至MRS培养基和加入L-半胱氨酸的改良MRS培养基进行乳酸杆菌和双歧杆菌的厌氧培养。选用平板计数法计数细菌数，以每克肠道内容物细菌总数的对数值lg (CFU/g)表示。1.4.3免疫器官指标饲喂第42 d，每个重复中随机选取5只黄羽鹌鹑称重，屠宰，分别摘取胸腺、脾脏和法氏囊，剔除各器官上的脂肪组织，利用滤纸吸去表面水分，称量各免疫器官重量。免疫器官指数=免疫器官重量/宰前活重(1)1.5数据统计与分析数据采用SPSS 19.0软件进行显著性分析和多重比较，结果以“平均值±标准差”表示。P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1蝇蛆抗菌肽对鹌鹑血液免疫指标的影响（见表3~5）由表3可知，与对照组相比，抗菌肽Ⅲ组的α1球蛋白和α2球蛋白水平极显著提高（P0.01），β球蛋白和γ球蛋白水平显著提高（P0.05）。与对照组相比，蝇蛆活体组α1球蛋白和α2球蛋白差异极显著（P0.01），β球蛋白和γ球蛋白水平无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.011.T003表3抗菌肽对黄羽鹌鹑血清球蛋白的影响组别α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白对照组1.40±0.38Cb2.64±0.44Bab7.37±0.27b12.28±0.20b抗菌肽Ⅰ组1.82±0.15Bb2.62±0.27Bb7.11±0.42b13.10±0.66ab抗菌肽Ⅱ组2.15±0.11Ba2.67±0.15Ba7.25±0.75b13.95±0.36ab抗菌肽Ⅲ组2.57±0.33Aa3.00±0.39Aa8.73±0.28a14.05±0.41a蝇蛆活体组1.93±0.42Bb2.51±0.27Cb7.21±0.63b13.04±0.77ab注：同列数据肩标小写字母不同表示差异显著（P0.05），字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05），大写字母不同表示差异极显著（P0.01）；下表同。%由表4可知，抗菌肽Ⅱ组IgG含量极显著高于对照组和蝇蛆活体组（P0.01），显著高于抗菌肽Ⅰ组（P0.05）。抗菌肽Ⅲ组IgA含量显著高于对照组和抗菌肽Ⅰ组（P0.05），蝇蛆活体组较对照组差异不显著（P0.05）。与对照组相比，抗菌肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组IgM含量有增加的趋势，但各处理间差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.011.T004表4抗菌肽对黄羽鹌鹑免疫球蛋白的影响组别IgG/(g/L)IgA/(g/L)IgM/(mg/L)对照组0.51±0.06Bb0.16±0.04b8.17±0.55抗菌肽Ⅰ组0.53±0.02ABb0.17±0.03b8.26±1.10抗菌肽Ⅱ组0.69±0.08Aa0.20±0.04ab8.23±0.93抗菌肽Ⅲ组0.62±0.09ABab0.27±0.09a8.25±0.86蝇蛆活体组0.52±0.02Bb0.18±0.02ab8.25±0.35由表5可知，鹌鹑日粮中添加蝇蛆抗菌肽和蝇蛆活体对补体含量无显著影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.011.T005表5抗菌肽对黄羽鹌鹑血清补体的影响组别C3C4对照组1.14±0.070.87±0.06抗菌肽Ⅰ组1.22±0.170.85±0.15抗菌肽Ⅱ组1.35±0.140.86±0.27抗菌肽Ⅲ组1.45±0.090.91±0.11蝇蛆活体组1.37±0.380.88±0.40g/L2.2蝇蛆抗菌肽对鹌鹑肠道菌群数量的影响（见表6）由表6可知，抗菌肽组盲肠内容物中大肠杆菌数量均极显著高于对照组（P0.01），而蝇蛆活体组较对照组大肠杆菌数无明显变化（P0.05）。抗菌肽Ⅲ组沙门氏菌数极显著低于其他各组（P0.01），且抗菌肽Ⅰ组显著低于蝇蛆活体组（P0.05）。抗菌肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组及蝇蛆活体组鹌鹑盲肠内乳酸杆菌的数量均极显著高于对照组（P0.01），随着抗菌肽添加量的提高，各组鹌鹑盲肠内乳酸杆菌的数量极显著提高（P0.01）。与对照组相比，抗菌肽Ⅱ组和抗菌肽Ⅲ组双歧杆菌数显著提高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.011.T006表6抗菌肽对黄羽鹌鹑肠道菌群数量的影响组别大肠杆菌沙门氏菌乳酸杆菌双歧杆菌对照组7.45±0.65Dd6.67±0.89ABab7.69±0.29Dd8.28±0.43ABbc抗菌肽Ⅰ组7.52±0.43Cc6.65±0.11ABb8.22±0.09Cc8.25±0.66Bc抗菌肽Ⅱ组8.26±2.07Aa6.62±0.40BCbc8.53±0.98Bb8.34±0.78Aa抗菌肽Ⅲ组8.02±0.08Bb6.59±0.54Cc8.69±0.85Aa8.35±0.29Aa蝇蛆活体组7.45±0.36Dd6.70±0.86Aa8.55±0.99Bb8.31±0.76ABablg CFU/g2.3抗菌肽对鹌鹑免疫器官指数的影响（见表7）由表7可知，抗菌肽Ⅲ组鹌鹑胸腺指数显著高于其他各组（P0.05）；日粮中添加蝇蛆抗菌肽和蝇蛆活体对鹌鹑的脾脏指数和法氏囊指数影响不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.011.T007表7抗菌肽对黄羽鹌鹑免疫器官指数的影响组别胸腺指数脾脏指数法氏囊指数对照组2.11±0.02b0.64±0.061.26±0.03抗菌肽Ⅰ组2.14±0.07b0.62±0.051.31±0.05抗菌肽Ⅱ组2.24±0.12b0.64±0.071.34±0.11抗菌肽Ⅲ组2.30±0.09a0.59±0.071.35±0.08蝇蛆活体组2.20±0.11b0.61±0.111.29±0.13mg/g3讨论3.1抗菌肽对黄羽鹌鹑血液免疫指标的影响动物机体免疫中，体液免疫占重要地位，抗体对病原体及毒素的中和、免疫调理以及强化细胞吞噬均与血清球蛋白含量有密切关系[7]。研究表明，AMPs参与第一道免疫防御，并通过不同机制调控机体免疫[8-9]。目前，有关抗菌肽提高家禽免疫性能报道较多。王莉等[10]研究显示，鹌鹑饲粮中添加抗菌肽和美酵素能改善生长性能，增强免疫功能，并且二者具有协同作用。王棚等[11]研究结果表明，产蛋后期鸡日粮中添加一定含量的抗菌肽Catesbeianin-1粗提物能够提高产蛋率和蛋品质，增强机体免疫功能。本试验中，在黄羽鹌鹑日粮中添加不同水平蝇蛆抗菌肽可以提高机体α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白的含量，并且随着添加量的提高，各血清球蛋白水平呈上升趋势，与上述研究报道一致。结果表明，蝇蛆抗菌肽可以在一定程度上提高血清球蛋白含量，增强免疫力。然而，蝇蛆活体组血清球蛋白含量较对照组无明显差异，与李广宏等[12]报道的蝇蛆活性蛋白可使机体抗病力大大增强不一致，原因可能是蝇蛆抗菌肽在宿主免疫反应不同阶段表现出不同作用。免疫球蛋白是机体免疫应答最主要的免疫分子，能够直接反映机体免疫状况。IgG在体内发挥抗菌、抗病毒、抗毒素等免疫学活性；IgA在局部抗感染中发挥作用；IgM在机体受到病原感染后与补体结合，是抗感染中起到先锋作用的一类免疫球蛋白。C3和C4是补体系统的主要成分，是反映动物机体健康状况的重要指标。田丽娜等[13]报道，饲粮中添加抗菌肽Sublancin可以显著增强蛋鸡免疫力，添加含量在100~200 mg/kg时作用效果具有剂量依赖性。本试验结果显示，抗菌肽组IgG、IgA和IgM含量均高于对照组，说明蝇蛆抗菌肽可以诱导鹌鹑体内免疫功能活化，促进免疫球蛋白合成，保持机体主动免疫能力。此外，随着蝇蛆抗菌肽水平的提高，补体C3、C4含量呈上升趋势，表明黄羽鹌鹑日粮中添加蝇蛆抗菌肽可以激活免疫系统，提高免疫力，与上述报道基本一致。3.2抗菌肽对黄羽鹌鹑肠道菌群的影响家禽肠道微生物菌群稳态对家禽营养、免疫和代谢都起着重要作用[14]。有研究报道[15-16]，家禽小肠消化道微生物菌群在2周内建立，而盲肠微生物菌群在6~7 w左右才逐渐建立，约40 d时，主要由粪链球菌、大肠杆菌、乳杆菌属亚种和拟杆菌属亚种构成的盲肠微生物菌群最终趋于稳定。盲肠是家禽消化道微生物活动最大的场所，对研究防治家禽感染性肠道疾病具有很高的实用价值[17]。目前，已有学者针对盲肠微生态菌群做出大量研究。丁修良等[18]研究表明，日粮中添加300 mg/kg的抗菌肽Sublancin可以明显降低肉鸡第21、42 d盲肠内容物中大肠杆菌和总需氧菌数。梁秀丽等[19]研究显示，抗菌肽B-13可以促进仔猪小肠形态发育，改善盲肠微生物菌群。目前，虽然尚未发现AMPs影响肠道微生物菌群的确切机制，但在解释抑菌活性归因于抗菌肽和病原体表面不同电荷。AMPs带有正电荷，可以通过静电作用附着在带有负电荷的细胞膜上，从而物理破坏细菌的磷脂双分子层，阻断酶活性或抑制蛋白质和核酸合成[20-22]。同时，AMPs可以选择性地抑制肠道中细菌生长，表明与抗生素相比，AMPs具有显著竞争优势[23-24]。本试验结果表明，日粮中添加蝇蛆抗菌肽能够显著提高盲肠有益菌乳酸杆菌、双歧杆菌数量，降低沙门氏菌数量，且随着抗菌肽含量的升高，效果越明显，与上述报道基本一致。结果表明，蝇蛆抗菌肽可以有效调节肠道益生菌的数量，改善肠道微生态环境，有利于鹌鹑肠道微生物平衡的迅速建立和维持，对机体稳态意义重大。然而，蝇蛆活体组盲肠内容物中大肠杆菌、沙门氏菌、双歧杆菌数量较对照组差异不显著（P0.05），与霍桂桃[25]和张浩等[26]将蝇蛆活体加工制粉后应用于动物机体的结果不一致，原因可能是蝇蛆生存状态不同引起的。另外，当蝇蛆抗菌肽添加量达到200 mg/kg时，鹌鹑肠道中大肠杆菌数量达到高峰，与李金莲[27]报道的中剂量抗菌肽作用效果明显优于低剂量和高剂量的研究结果不一致，原因可能是动物品种、日龄、饲粮营养成分[28-31]和应激情况[32-33]不同等引起的。同时，该结果又可在一定程度上说明蝇蛆抗菌肽对动物肠道菌群仍存在有一定调控作用，盲肠内容物中大肠杆菌数梁是否会随着抗菌肽水平的提高得到抑制，有待于进一步研究。3.3抗菌肽对黄羽鹌鹑免疫器官指数的影响免疫器官指数反映免疫器官生长发育状况。免疫器官发育状态及机能强弱，直接决定禽类机体免疫水平。胸腺作为中枢免疫器官，在培育T淋巴细胞过程中起着关键作用。脾脏是禽类最大的外周免疫器官，参与全身细胞免疫和体液免疫；法氏囊又称腔上囊，是B细胞诱导、分化、发育场所。结果表明，免疫器官体积的变化实际上受淋巴细胞凋亡与细胞增殖速度影响[34]，而抗菌肽能在机体免疫调节和免疫稳态方面起重要作用[35]。本试验结果显示，添加不同水平蝇蛆抗菌肽对黄羽鹌鹑免疫器官指数有一定增长趋势，特别是抗菌肽Ⅲ组胸腺指数较对照组差异显著（P0.05），与上述报道结果基本一致，说明蝇蛆抗菌肽能够促进黄羽鹌鹑胸腺细胞发育成熟，提高机体免疫活性，从而增强抵抗外来疾病能力。4结论本研究结果表明，基础日粮中添加蝇蛆抗菌肽可以显著提高黄羽鹌鹑血清球蛋白含量，促进免疫球蛋白的合成，增加肠道有益菌乳酸杆菌和双歧杆菌数量，降低沙门氏菌数量，增强免疫器官发育，且在添加量达到300 mg/kg时效果较好。