随着养殖业的快速发展，能量饲料玉米相对紧缺。小麦类饲料原料营养价值较高、产量大、价格较玉米低，用来代替玉米作为潜在畜禽能量饲料原料，可以缓解市场上玉米紧缺带来的压力。但麦类饲料含抗营养因子非淀粉多糖（NSP），能够降低饲料消化率，影响动物生长，从而严重影响麦类饲料的饲喂价值。减轻麦类饲料中NSP的抗营养作用一直是人们关注的热点。木聚糖酶可以降解木聚糖。对于含大量阿拉伯木聚糖的NSP，使用木聚糖酶可以有效减轻饲料中NSP的抗营养作用，提高营养物质消化率和动物生长性能[1-3]。木聚糖酶制剂在生猪养殖和家禽养殖中已展现出优异的促生长效果，但谷物中存在能抑制外源添加木聚糖酶活性的木聚糖酶抑制蛋白会削弱外源添加木聚糖酶的作用效果[4-6]。因此，利用基因工程技术获得抗抑制性木聚糖酶来减轻或克服木聚糖酶抑制蛋白的抑制作用具有重要意义。文章综述抗抑制活性木聚糖酶的研究进展，为麦类饲料能更好地在畜禽日粮中的应用提供参考。1木聚糖酶抑制蛋白1.1木聚糖酶抑制蛋白的分类木聚糖酶抑制蛋白是植物细胞中存在的对木聚糖酶起抑制作用的蛋白质[7]。木聚糖酶抑制蛋白广泛存在于小麦、大麦、燕麦、水稻、玉米等谷物中[8-9]。小麦中已证实有3种木聚糖酶抑制蛋白存在，即TAXI（triticum aestivum xylanase inhibitor）、TLXI（thaumatin-like xylanase inhibitor）、XIP（xylanase inhibiting protein）。每种抑制蛋白均有若干同源物[10]。谷物木聚糖酶抑制蛋白只抑制外源木聚糖酶的活性，不抑制谷物内源木聚糖酶的活性[11]。除小麦以外，黑麦、大麦、玉米、燕麦、水稻等谷物中均发有木聚糖酶抑制蛋白的存在[9]。但不同种类的谷物中，木聚糖酶抑制蛋白存在的类型和比例不同。如玉米和水稻中只发现存在XIP型木聚糖酶抑制蛋白，TAXI型木聚糖酶抑制蛋白未发现[12]。1.2木聚糖酶抑制蛋白的分子结构及其理化性质目前，谷物中发现3种木聚糖酶抑制蛋白TAXI、XIP和TLXI。TAXI的分子量约为40 kDa，等电点显碱性，无糖基化位点。TAXI以2种形式存在：第1种形式是一整条全长蛋白；第2种形式由第1种形式经水解加工演化而来，包含两个分子量为29 kDa和11 kDa的多肽，2条肽链间通过二硫键连接[13]。XIP的分子量约为30 kDa，等电点显碱性，糖基化程度较高[14]。TLXI的分子量约为18 kDa，等电点也显碱性，含5个二硫键，多数有O-糖基化位点且位置可变，一般物理化学方法很难去掉其抑制活性[12]。木聚糖酶抑制蛋白和木聚糖酶结构中某些氨基酸残基是它们互作的结构基础。这些氨基酸残基的变化会导致抑制活性的降低，甚至丧失。如TAXI中的天冬氨酸，当突变为碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基后，TAXI不再抑制木聚糖酶的活性。TAXI-I中的组氨酸残基作用于木聚糖酶活性位点的2个谷氨酸残基可以抑制曲霉产生的11家族木聚糖酶的活性。曲霉产木聚糖酶“拇指”发卡环状结构的Asnll7位点是XIP-I结合的位点。细菌产木聚糖酶β4、β7和β83条链之后，插入的氨基酸残基可以形成立体结构阻碍与XIP的结合。当前，通过TAXI、XIP和TLXI的克隆，在大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母中的表达[15-16]，获得重组的木聚糖酶抑制蛋白，其抑制活性和抑制特异性与天然的木聚糖酶抑制蛋白相同。1.3谷物中木聚糖酶抑制蛋白的抑制特异性为免受微生物或昆虫分泌木聚糖酶破坏，植物组织会产生木聚糖酶抑制蛋白来削弱或阻止病原菌对植物细胞壁的降解。木聚糖酶抑制蛋白能抑制外源木聚糖酶的活性[17]。植物种子在萌发过程中需要产生木聚糖酶来重建细胞壁，植物产生的木聚糖酶抑制蛋白不抑制植物产木聚糖酶的活性。木聚糖酶抑制蛋白对微生物产木聚糖酶的抑制机制非常复杂。TAXI只抑制微生物产G11家族木聚糖酶的活性，对G10的活性无影响。且TAXI的两个亚型TAXI-I和TAXI-Ⅱ中，TAXI-Ⅱ只抑制细菌产GH11家族木聚糖酶的活性。TLXI属于慢性紧密结合抑制剂，能非竞争性抑制大部分GH11家族木聚糖酶的活性。XIP抑制真菌产G10和GH11家族木聚糖酶的活性，对细菌产木聚糖酶的活性无影响[12]。TAXI和XIP同属于竞争型抑制剂。生产中，由于环境的影响，不同谷物品种、不同生长阶段木聚糖酶抑制蛋白的含量不同。对于小麦，TAXI、XIP和TLXI的含量在不同品种间变化幅度为17~200、156~560、51~150 µg/g[17-18]。谷物中木聚糖酶抑制蛋白的类型和含量均会严重影响外源木聚糖酶的准确添加量及应用效果，严重阻碍外源木聚糖酶在畜禽麦类饲料中的应用。TAXI对木聚糖酶的抑制作用通过His（或Glu）的残基来完成。TAXI的咪唑环插在木聚糖酶活性位点2个Glu残基之间，可以取代木聚糖酶底物结合位点-l处木糖C1的位置[19]。因此，TAXI木聚糖酶活性位点的氨基酸突变能够严重影响TAXI与木聚糖酶的结合[20-21]。XIP-I抑制GH10和GH11家族木聚糖酶的关键位点分别是Lys234和Arg149。如对木聚糖酶活性位点及GH11家族木聚糖酶结构“拇指区”进行定点突变，能改变XIP对木聚糖酶的抑制作用[22]。TLXI对木聚糖酶的抑制作用位于木聚糖酶活性位点外面，当其氨基酸序列第22位带正电荷的His跟GH11家族木聚糖酶中带负电的残基作用后，会破坏木聚糖酶的动力学特性或者使木聚糖酶的构象发生变化，从而抑制木聚糖酶的活性[23]。通过对一些已知抑制蛋白结合位点的木聚糖酶进行定点突变，并保障木聚糖酶分解活性的正常发挥，可以解除抑制蛋白对酶的抑制作用。2抗抑制活性木聚糖酶的潜在应用价值谷物中木聚糖酶抑制蛋白严重影响谷物饲料在畜禽生产中的应用。在小麦型基础日粮中分别添加0、60、120、180、240和300 mg/kg木聚糖酶，可以明显观察到木聚糖酶抑制蛋白对外源木聚糖酶的抑制作用[24]。在该研究中，尽管22~42 d肉鸡饲料转化率在添加木聚糖酶后差异显著，但随着木聚糖酶添加量的增加，各组间饲料转化率差异不显著，可见多添加的木聚糖酶活性受到抑制。添加木聚糖酶后，1~21 d肉鸡对能量、粗蛋白和干物质的消化率显著提高，但随着木聚糖酶添加量的增加，肉鸡对能量、粗蛋白和干物质的消化率各组间差异不显著；肉鸡对粗脂肪、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的消化率各组间差异不显著，随着木聚糖酶添加量的增加，22~42 d肉鸡对能量、干物质和中性洗涤纤维的消化率各组间差异也不显著。上述数据均表明，随着木聚糖酶添加量的增加，木聚糖酶活性受到抑制。Hanczakowska等[25]在黑小麦和黑麦日粮中分别添加8 000、16 000、24 000 BXU/kg木聚糖酶，发现随着木聚糖酶添加量的增加，木聚糖酶的活性受到抑制。使用该日粮饲喂猪，对于27~90 kg与27~110 kg的猪，平均日增重随着饲粮中木聚糖酶添加量的增加，各组间差异不显著；27~110 kg阶段，饲料转化效率随着木聚糖酶添加量的增加，各组间差异也不显著；生长阶段日粮，对于猪营养物质的消化率随着木聚糖酶添加量的增加，各组间差异不显著；育肥阶段日粮，干物质、粗脂肪和无氮浸出物的消化率随着木聚糖酶添加量的增加，各组间差异也不显著。上述数据均表明，随着木聚糖酶含量的增加，木聚糖酶的活性受到抑制。上述研究结果与徐叶桐等[24]相似，麦类饲粮中随着外源木聚糖酶添加量的增加，外源木聚糖酶的活性受到抑制。Madsen[26]发现，小麦饲粮中高含量的木聚糖酶抑制蛋白会影响肉鸡的体重增长。Leys等[27]在面包制作过程中，使用对TAXI敏感的野生型枯草芽孢杆菌木聚糖酶XBSTAXI，对TAXI敏感度降低的突变体XBSNI和对所有小麦木聚糖酶抑制蛋白都敏感的突变体XBSTI时，为了获得相同量的面包，与受抑制较少的XBSNI酶相比，XBSTAXI的用酶量为XBSNI酶的7倍，XBSTI的用酶量为XBSNI酶的53倍。XBSTAXI和XBSTI只在面粉搅拌过程中和发酵初期起作用，XBSNI直到发酵结束均能够水解阿拉伯木聚糖。研究解释了徐叶桐等[24]和Hanczakowska等[25]初期添加木聚糖酶有效果，但随着木聚糖酶添加量的增加，各组间差异不显著的原因。Leys等[27]研究发现，与敏感酶用量相比，抗性酶用量要少，使用抗性酶能获得更大的用酶效益。因此，抗抑制活性木聚糖酶的使用具有显著的潜在应用价值。3抗抑制活性木聚糖酶的研究现状及应用前景木聚糖酶归属于糖苷水解酶第5、7、8、10、11和43家族，其中大部分木聚糖酶都属于11家族和10家族。10家族的木聚糖酶分子量较大，多属于多结构域酶；11家族的木聚糖酶分子量较小，多属于单结构域酶。王梦迪[28]对构巢曲霉设计了33个突变体，其中11个突变体没有检测到木聚糖酶的活性，只有2个突变体的抑制率较野生型下降较多。Sørensen等[29]对属于11家族的枯草芽孢杆菌XynA木聚糖酶的22个残基进行突变，得到62个突变体；经抑制蛋白TAXI和XIP的抑制试验，抗抑制活性结果表明只有该木聚糖酶D11位点的突变，可以解除枯草芽孢杆菌XynA的抗抑制活性。结果表明，通过突变方式获得抗抑制性木聚糖酶工作量很大，不同谷物中含有的抑制蛋白类型和数量不同导致获得的抗性酶在使用过程中面临很多问题。朱东东[30]将源自Neocallimastix sp. GMLF1的木聚糖酶Xyn1B与抑制蛋白XIP-I按摩尔比1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10检测时，发现木聚糖酶Xyn1B的活性不会随着XIP-I量的增加而出现大幅度的下降，Xyn1B的活性始终保持在99%~100%，表明木聚糖酶Xyn1B是抗XIP-I抑制性的酶。在对木糖释放量的影响方面，抗性酶Xyn1B在添加XIP-I与无XIP-I的情况下，木糖释放量仅变化0.17 g/L，差异不显著，说明XIP-I的添加并不影响Xyn1B的活性；敏感酶在添加XIP-I与无XIP-I的情况下木糖释放量变化0.635g /L，差异显著，间接证明大麦中存在的木聚糖酶抑制蛋白会影响敏感酶的糖化过程。对麦芽汁澄清度影响方面，添加0.4 mg XIP-I后，抗性酶组麦芽汁澄清度相较于无XIP-I添加下无明显变化；敏感酶组麦芽汁澄清度相较于无XIP-I添加的情况下，添加XIP-I使麦芽汁的澄清度降低31%，差异显著。上述数据表明，不受抑制蛋白抑制的抗性酶在应用过程中可以避开抑制蛋白的影响，提高使用酶的效益。当前木聚糖酶的生产、应用及分子改良研究绝大部分集中于细菌和真菌源木聚糖酶，关于植物来源木聚糖酶研究较少。能够产内源木聚糖酶的植物仅有大麦、小麦、玉米、拟南芥、鳄梨及木瓜等。马名章[31]对水稻内源木聚糖酶OSX基因进行克隆和表达，获得的水稻内源木聚糖酶S-OSX对抑制剂RIXI几乎无抑制作用。黄莹莹等[32]对水稻内源木聚糖酶osx基因进行克隆，并实现该基因的原核活性表达，表达蛋白约40 kDa，木聚糖酶活性为11.53 IU/mL。Guo等[33]从小麦芽提取和纯化了小麦内源木聚糖酶，该木聚糖酶的分子量为27.8 kDa，经12.08倍纯化，比活为4.47 U/mg。根据木聚糖酶抑制蛋白只作用于外源微生物木聚糖酶，对植物内源木聚糖酶不起作用的特性，如果能获得大量植物内源的木聚糖酶用于生产，将会使抗性酶的获得和使用更省时、省力。4展望未来可以开发不受抑制蛋白抑制的商品木聚糖酶以利于提高用酶效益，节约经济成本。当前无植物源木聚糖酶用于生产的研究，有待科研人员的进一步研究。