奶牛在围产期（产前21 d~产后21 d）会对分娩、泌乳和环境等产生应激，此时期的奶牛干物质采食量不足和能量输出加剧会导致能量负平衡[1-2]（NEB），诱发奶牛机体氧化应激和代谢紊乱。蛋氨酸（Met）是反刍动物限制性氨基酸，对动物机体十分重要[3]。反刍动物对饲料中蛋氨酸利用率仅有40%~80%[4]，因为反刍动物瘤胃微生物会降解Met，饲粮中通常添加保护性蛋氨酸用于反刍动物Met补充。2-羟基-4-甲硫基-丁酸异丙醇酯[2-hydroxy-4- (methylthio) butanoic acid isopropyl ester，HMBi]是一种生物学价值较高的过瘤胃蛋氨酸[5]，可以为反刍动物提供Met[6]。在日粮中添加HMBi能够提高反刍动物生长性能，改善机体免疫力，提高养殖经济效益[7-8]。Han等[9]发现，在奶牛日粮中添加HMBi可以增加血清中总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）含量及谷丙转氨酶（ALT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。郗伟斌等[10]发现，补充HMBi对奶牛尿素氮（BUN）、总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）含量影响不显著，但有降低TC含量的趋势。HMBi可以降低血清中β-羟丁酸（BHBA）、TC和丙二醛（MDA）含量，增加血清中总抗氧化能力（T-AOC）和GSH-Px的活性[11]。在荷斯坦奶牛围产期添加HMBi的报道较少，因此，本研究评估在围产期前添加HMBi对荷斯坦奶牛产前7 d和产后7 d生产性能和免疫功能的影响。1材料与方法1.1试验设计试验根据年龄、胎次、体况、预产期相近的原则，选取围产前期40头荷斯坦奶牛按配对原则分为2组，每组20头，设为对照组和试验组。对照组奶牛饲喂基础日粮，试验组饲喂基础日粮+30 g/d HMBi（法国安迪苏）。试验期共44 d，奶牛转入围产圈开始饲喂HMBi，直至产犊。奶牛饲喂TMR，每天投料2次，自由饮水。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.T001表1基础日粮组成及营养水平（干物质基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米10.77泌乳净能/(MJ/kg)5.98豆粕2.27粗蛋白质/%12.00棉籽粕9.07中性洗涤纤维/%52.30酒糟蛋白饲料3.83钙/%0.77预混料2.27磷/%0.34其他0.14玉米青贮17.08燕麦草31.89稻草22.68注：1.预混料购自宁夏大北农实业科技有限公司。2.其他包含活性酵母、脱霉剂、过瘤胃氨基酸。1.2样品采集每组选择6头奶牛，分别在产前7 d和产后7 d的早晨饲喂前，进行尾静脉采集血样10 mL，3 000 r/min离心10 min，将血清转移至Eppendorf管中，-80 ℃冰箱保存，备用。1.3测定指标及方法测定血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白（GLB）、尿素氮、甘油三酯、总胆固醇、葡萄糖（GLU）、β-羟丁酸、免疫球蛋白G（IgG）、白细胞介素2（IL-2）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛和总抗氧化能力等指标。TP、ALB、BUN、TG、TC和GLU采用全自动生化分析仪测定（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，BS-180及其配套试剂盒）；IgG、IL-2、TNF-α和BHBA采用酶联免疫吸附剂法（ELISA）测定；T-AOC、MDA、GSH-Px和SOD试剂盒均购自武汉基因美生物工程有限公司，按相应说明书使用A6半自动生化分析仪（北京松上技术有限公司）检测。1.4数据统计与分析数据采用Excel 16.0整理，采用SPSS 20.0软件进行单因素方差（One-way ANOVA）分析。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1围产前期添加HBMi对奶牛产前7 d和产后7 d血液生化指标的影响（见表2）由表2可知，与对照组相比，试验组产前7 d血清TP含量增加2.0%（P0.05），产后7 d血清TP含量显著增加4.0%（P0.05）；试验组产前7 d血清ALB、GLU含量和ALP活性分别增加5.2%、2.1%和4.3%（P0.05）；试验组产后7 d血清ALB、GLU含量和ALP活性分别增加4.5%、1.4%和4.7%（P0.05）；试验组产前7 d血清BUN和BHBA含量分别降低4.1%和2.0%（P0.05）；试验组产后7 d血清BUN和BHBA含量分别降低3.8%和4.9%（P0.05）；试验组产前7 d血清TC含量降低4.7%（P0.05），产后7 d血清TC含量增加11.4%（P0.05）；试验组产前7 d血清AST活性降低7.9%（P0.05），产后7 d血清AST活性显著降低15.4%（P0.05）；试验组产前7 d血清ALT活性降低4%（P0.05），产后7 d血清ALT活性显著降低16.4%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.T002表2围产前期添加HBMi对奶牛产前7 d和产后7 d血液生化指标的影响项目产前7 d产后7 d对照组试验组对照组试验组TP/(g/L)67.29±3.2168.66±1.5567.65±2.4170.35±2.86*ALB/(g/L)29.10±1.7930.61±1.8727.60±3.1928.83±1.38GLB/(g/L)38.19±3.5538.05±1.7140.05±2.1541.53±2.37A/G0.80±0.090.80±0.050.69±0.110.69±0.06TC/(mmol/L)2.33±0.352.22±0.392.02±0.522.25±0.37TG/(mmol/L)0.21±0.040.21±0.050.16±0.050.16±0.04GLU/(mmol/L)3.26±0.153.33±0.343.48±0.153.53±0.36BUN/(mmol/L)3.40±0.373.26±0.453.15±0.623.03±0.32BHBA/(mg/L)9.58±2.029.39±1.708.91±1.888.47±1.75AST/(U/L)89.00±10.0281.95±10.3292.20±12.6877.96±10.39*ALT/(U/L)23.18±4.4922.18±2.9024.15±4.2520.18±2.97*ALP/(U/L)44.36±4.9146.25±7.8045.41±5.0947.56±5.04注：同一时期同行数据肩标“*”表示差异显著（P0.05），“**”表示差异极显著（P0.01）。2.2围产前期添加HBMi对奶牛产前7 d和产后7 d血液免疫指标的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，产前7 d和产后7 d试验组血清IgG的含量差异不显著（P0.05）；试验组产前7 d血清IL-2含量降低10.7%（P0.05），产后7 d血清IL-2含量增加1.70%（P0.05）；试验组产前7 d血清TNF-α含量增加5.9%，产后7 d血清TNF-α含量降低6.5%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.T003表3围产前期添加HBMi对奶牛产前7 d和产后7 d血液免疫指标的影响时间组别IgG/(mg/L)IL-2/(μg/L)TNF-α/(g/mL)产前7 d对照组18.30±3.58192.07±37.7786.15±11.56试验组17.90±4.33171.52±30.8691.29±17.46产后7 d对照组16.97±2.51192.96±33.2389.20±11.16试验组15.96±1.55196.24±40.0583.35±15.192.3围产前期添加HBMi对奶牛产前7 d和产后7 d血液抗氧化指标的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，试验组产前7 d血清GSH-Px活性、T-AOC和SOD活性分别增加7.2%、11.6%和1.5%（P0.05）；试验组产后7 d血清GSH-Px活性、T-AOC和SOD活性分别增加0.5%、11.3%和12.1%（P0.05）；试验组产前7 d血清MDA含量降低9.0%（P0.05），产后7 d血清MDA含量降低8.8%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.T004表4围产前期添加HBMi对奶牛产前7 d和产后7 d血液抗氧化指标的影响时间组别T-AOC/(U/mL)GSH-Px/(U/mL)SOD/(U/mL)MDA/(μmol/L)产前7 d对照组7.70±3.55659.56±237.8769.91±15.505.05±1.39试验组8.59±3.78707.34±262.7970.97±15.754.55±1.28产后7 d对照组9.14±3.13767.03±151.5568.60±7.544.09±1.12试验组10.17±3.56770.87±273.7876.91±13.243.73±1.273讨论3.1围产前期添加HMBi对奶牛血液生化及免疫指标的影响血液能够运输营养物质，参与机体内体液调节。血液生化指标的改变是组织细胞通透性和机体新陈代谢机能变化结果，主要受动物的生长阶段、营养水平及内分泌状态等多种因素影响。畜禽机体的生理及代谢状况可以由畜禽血液的生理生化指标反映。血清蛋白是血液脂肪酸载体，含量与日粮中蛋白质摄入量有关。TP由ALB与GLB组成，代表日粮中蛋白质水平以及机体对蛋白质消化吸收程度。在反刍动物中，TP和ALB含量降低表明蛋白质缺乏和营养不良[12]。血清TP含量降低可能因为肝脏合成蛋白质功能出现障碍。本试验结果显示，每天补充30 g HMBi可以提高血清TP和ALB含量，试验表明，添加HMBi可能改善体内蛋白质代谢。本研究中，试验组血清BUN含量与对照组相比有所降低，但差异不显著，这与张成喜等[13]的研究结果一致。血清BUN反映体内氨基酸平衡和蛋白质代谢情况，血清中BUN含量过高，饲料中氮利用效率则会降低。杨维仁等[14]在研究瘤胃投饲不同形式蛋氨酸对肉牛营养物质消化率和血液指标影响中指出，限制性氨基酸的缺乏会影响其他氨基酸代谢，最终不能利用的氨基酸经鸟氨酸循环生成尿素。添加HMBi可以改善日粮氨基酸水平，提高日粮蛋白质利用率，这可能是HMBi降低血液尿素氮含量的原因。在围产期期间，自身会动员体脂来支持胎儿生长和自身产奶，导致奶牛处于NEB状态[15]。NEB使奶牛动员体脂或体蛋白来满足能量需要，脂肪分解会产生非酯化脂肪酸（NEFA），NEFA不完全氧化会生产酮体，导致酮病或重新合成脂肪沉积在肝脏中，造成脂肪肝[16]。Met能够在体内经过转硫途径生产牛磺酸。在肝脏中，牛磺酸可以与胆汁酸结合形成牛黄胆酸盐，促进脂质吸收和胆固醇消耗。Met作为奶牛卵磷脂甲基供体，可以提高血清中脂蛋白含量，促进脂代谢。杨保奎等[17]研究表明，在产前基础日粮中添加20和30 g/d HMBi，可以改善血清生化指标，促进机体脂代谢。本试验中，围产前期添加HMBi对奶牛产前7 d和产后7 d TC和TG含量无影响。国外研究结果表明，在奶牛围产期加入HMBi，可以使临床酮病发生率降低，补充Met对肝脏脂质代谢有影响[18]。因此，围产前期添加HMBi有降低血清β-羟丁酸含量趋势。组织和细胞活动需要能量，这些能量主要由GLU提供。血液中GLU还可以转化为其他物质储存在机体或畜产品中[19]。因此，正常水平的血清GLU含量可以维持机体器官和组织的正常功能。本试验中，与对照组相比试验组血清GLU含量有提高趋势。Berthiaume等[20]研究表明，每天向奶牛日粮中添加72 g过瘤胃蛋氨酸可以使血液中GLU含量增高，与本研究结果一致。ALT和AST是动物体内机体代谢过程中两种酶[21]，是判断肝脏健康状况指标，高活性的AST会给肝脏带来损伤，ALT活性会随着肝脏损伤程度而升高，与动物生产性能和生长发育有一定关系[22]。张成喜等[13]在研究RP-Met对奶牛血液生化指标和养分消化率影响中的结果与本试验相同。Osorio等[23]研究发现，血清Met水平升高可以促进肝功能，减少炎症并改善氧化应激能力。氧化应激通过引起细胞膜过氧化损伤，增强受影响组织促炎状态来促进疾病发病[24]。Met是细胞内源性抗氧化剂[25]，可以降低氧化应激和炎症反应，有助于奶牛围产期更好过渡。补充HBMi可以提高围产期奶牛体内Met水平[26]，围产期补充Met可使奶牛炎症反应减弱。肿瘤坏死因子（TNF）是一种炎性细胞因子。氧化应激条件促进TNF-α形成，在炎症条件下产生和分泌会增加。白细胞介素（IL）是一类由单核-巨噬细胞和T淋巴细胞所分泌细胞因子，在免疫调节和炎症反映中发挥着重要作用。白细胞介素-2又称T细胞生长因子，可以促进细胞增殖和抗体分泌。IL-2浓度提升对增强机体免疫应答能力，提高动物机体免疫水平有积极作用。本研究中，围产前期饲喂30 g/d HMBi，对奶牛血清中IgG、TNF-α和IL-2含量均无显著影响，与孙菲菲试验结果相一致[11]。通过对血清标志物分析表明，添加HMBi提高奶牛免疫力。3.2围产前期添加HMBi对奶牛血液抗氧化指标的影响氧化应激是自由基和清除自由基的失衡，当奶牛机体发生氧化应激时，体内自由基增加，机体抗氧化系统启动。当体内氧化物水平大于抗氧化水平时，机体平衡就会被打破，氧化系统和抗氧化系统之间失衡。围产期补充HMBi将为动物机体提供Met，Met可以通过转硫作用通路合成体内最重要的强抗氧化剂（谷胱甘肽），机体强抗氧化剂谷胱甘肽合成量增加，表明奶牛抗氧化应激能力增强。蛋白质中Met可作为细胞内源性抗氧化剂，蛋氨酸残基和Ros会形成蛋氨酸亚砜，清除活性物质，调节酶活性[25]。细胞含有蛋氨酸亚砜还原酶，可以催化蛋氨酸亚砜还原成Met，因此蛋氨酸残基可以充当催化抗氧化剂，即保护所在蛋白质又保护其他大分子。T-AOC是血清抗氧化剂状态可靠且准确的指标，反映系统性代谢相互作用以及氧化剂和抗氧化剂之间平衡。GSH-Px和SOD是消除活性氧以防止氧化应激的两种酶，其中SOD可作为细胞抗氧化剂[27]；MDA是被自由基氧化的脂质氧化最终产物。赵瑞英等[28]研究蛋氨酸羟基类似物对肉鸡抗氧化能力及代谢激素的影响，发现添加蛋氨酸羟基类似物可以提高机体T-AOC，降低MDA含量。唐波等[29]发现，每天在徐州黄牛日粮中添加8 g HMBi能够增强肉牛抗氧化能力。饲喂HMBi可以降低山羊血清中SOD活性和MDA含量[30]。产前补充蛋氨酸锌（Zn-Met）可以提高SOD活性以及T-AOC，IL-2含量线性上升，补充Zn-Met可以改善奶牛抗氧化活性[31]。王群等[32]研究不同蛋白质水平日粮添加HMBi对奶牛生产性能及血液生化指标影响，发现在日粮中添加HMBi能够提高奶牛生产性能及抗氧化能力，对奶牛营养物质代谢相关代谢物质有促进作用。本试验在奶牛围产期补充HMBi，发现产前7 d和产后7 d试验组血清T-AOC、GSH-Px、SOD活性呈上升趋势，MDA含量呈下降趋势，与上述结果相一致。结果表明，在奶牛围产前期日粮中添加30 g/d HMBi能够提高机体抗氧化能力。4结论本试验结果显示，日粮中添加HMBi可以改善体内蛋白质代谢，改善奶牛机体炎症和氧化应激状态，增强机体抗氧化能力。