近年来，杂交构树凭借着自身适应性强、粗蛋白含量丰富和年产量高等优点得到迅速推广。在动物日粮中添加一定比例的构树饲料可以增加畜禽采食量，提高生长性能[1-4]。构树中还含有大量不饱和脂肪酸、生物碱、黄酮类等生物活性成分，具有杀菌消炎及抗氧化功能。饲喂构树饲料具有增强畜禽免疫力、提高畜产品品质功能[5-7]。但是构树中的粗蛋白以结构复杂的大分子形式存在，阻碍动物消化吸收[8]。酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌等作为益生菌被广泛应用于发酵饲料中[9]。利用益生菌对构树饲料进行发酵可显著提高畜禽对营养物质的消化率，改善动物肠道健康[10-12]。酸溶蛋白含量作为评价发酵饲料蛋白品质指标，主要包括游离的氨基酸和多肽。饲料中酸溶蛋白比例较高可明显提高畜禽对蛋白质消化吸收[13]。因此，试验以全株构树为试验材料，选择产朊假丝酵母、植物乳杆菌及枯草芽孢杆菌作为发酵菌株，探究不同的菌种组合以及发酵条件对酸溶蛋白含量的影响，筛选出最优菌种组合及附加条件。1材料与方法1.1试验材料全株构树发酵培养基包含全株构树干粉和糖蜜、麸皮、稻糠、玉米粉等辅料，全株构树干粉为河南兰考地区10月份第三茬收割材料经晾干粉碎制成。本试验所用菌种产朊假丝酵母（CGMCC 2.2878，≥1.0×108 CFU/mL）、枯草芽孢杆菌（≥1.0×109 CFU/mL）、植物乳杆菌（CGMCC 1.1856，≥1.0×109 CFU/mL），均由河南省科学院生物研究所有限责任公司提供。1.2试验设计1.2.1菌种组合的确定分别利用产朊假丝酵母、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌进行单菌株发酵，利用产朊假丝酵母和植物乳杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母、三种菌株协同发酵，并以未加菌的处理为对照组。发酵温度35 ℃、含水量52%、接菌量10%、发酵时间4 d、装料量50 g/250 g。1.2.2单因素条件的确定发酵温度的确定：含水量60%、接菌量8%、发酵时间3 d、装料量50 g/250 g、枯草芽孢杆菌与产朊假丝酵母添加比例1∶1，分别置于32、35、38、41和44 ℃温度下进行发酵。含水量的确定：发酵温度35 ℃、接菌量8%、发酵时间3 d、装料量50 g/250 g、枯草芽孢杆菌与产朊假丝酵母添加比例1∶1，分别设置含水量为48%、52%、56%、60%和64%。接菌量的确定：发酵温度35 ℃、含水量60%、发酵时间3 d、装料量50 g/250 g、枯草芽孢杆菌与产朊假丝酵母添加比例1∶1，接菌量分别为2%、5%、8%、11%和14%进行发酵。发酵时间的确定：发酵温度35 ℃、含水量60%、接菌量8%、装料量50 g/250 g、枯草芽孢杆菌与产朊假丝酵母添加比例1∶1，分别设置发酵时间为1、2、3、4和5 d。装料量的确定：发酵温度35 ℃、含水量60%、接菌量8%、发酵时间3 d、枯草芽孢杆菌与产朊假丝酵母添加比例1∶1，分别设置装料量为30、40、50、60、70和80 g。枯草芽孢杆菌与产朊假丝酵母添加比例的确定：发酵温度35 ℃、含水量60%、接菌量8%、发酵时间3 d、装料量50 g/250 g，枯草芽孢杆菌与产朊假丝酵母添加比例分别设置为6∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4。1.3试验方法1.3.1检测方法发酵结束后取适量材料置于65 ℃烘箱中24 h，取烘干后材料1.000 0 g置于50 mL离心管中，加入20 mL 15%三氯乙酸处理1 h，离心取上清。酸溶蛋白含量利用凯氏定氮法进行检测，具体操作参考GB/T 6432—1994《饲料中粗蛋白测定方法》。1.3.2数据统计与分析数据采用SPSS 22软件进行分析，采用Duncan氏法进行多重比较分析，利用Design Expert 10进行正交试验设计及分析，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同菌种组合处理对全株构树发酵饲料酸溶蛋白含量的影响（见表1）由表1可知，复合菌发酵试验中，枯草芽孢杆菌与产朊假丝酵母混合发酵饲料酸溶蛋白含量比对照组显著提高16.1%（P0.05）；三种菌株混合发酵酸溶蛋白含量显著低于对照组（P0.05）。因此，确定最佳菌种组合为枯草芽孢杆菌与产朊假丝酵母混合发酵。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.018.T001表1不同菌种组合处理对全株构树发酵饲料酸溶蛋白含量的影响组别菌种比例酸溶蛋白/%单菌发酵产朊假丝酵母—5.02±0.11c植物乳杆菌—5.57±0.21b枯草芽孢杆菌—5.82±0.21b复合菌发酵产朊假丝酵母+植物乳杆菌1∶15.71±0.04b产朊假丝酵母+枯草芽孢杆菌1∶16.27±0.35a植物乳杆菌+枯草芽孢杆菌1∶15.75±0.04b产朊假丝酵母+植物乳杆菌+枯草芽孢杆菌1∶1∶14.28±0.17d未加菌（对照组）——5.40±0.14bc注：同列数据肩标字母相同表示差异不显著（P0.05），字母不同表示差异显著（P0.05）。2.2不同发酵条件对全株构树饲料酸溶蛋白含量的影响2.2.1温度对饲料中酸溶蛋白含量的影响（见图1）由图1可知，随着发酵温度的提高饲料中酸溶蛋白的含量表现为先升高的趋势，发酵温度为38 ℃时，含量最高，温度高于38 ℃时，酸溶蛋白含量表现为持续降低。由此可见，38 ℃对于饲料酸溶蛋白含量效果最佳。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.018.F001图1温度对饲料酸溶蛋白含量的影响2.2.2含水量对饲料中酸溶蛋白含量的影响（见图2）由图2可知，饲料含水量为48%时，酸溶蛋白含量最低，含水量达到56%时，酸溶蛋白含量最高，含水量高于56%后出现降低的趋势。因此确定含水量为56%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.018.F002图2含水量对饲料酸溶蛋白含量的影响2.2.3接菌量对饲料中酸溶蛋白含量的影响（见图3）由图3可知，随着接菌量的增加酸溶蛋白含量逐渐升高，接菌量达到8%时酸溶蛋白含量最大，接菌量大于8%时出现降低的趋势。因此选择8%作为最佳接菌量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.018.F003图3接菌量对饲料酸溶蛋白含量的影响2.2.4发酵时间对饲料中酸溶蛋白含量的影响（见图4）由图4可知，饲料中酸溶蛋白的含量随着发酵时间的延长变现为先升高后降低的趋势，发酵时间为3 d时效果最佳。因此确定发酵时间为3 d。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.018.F004图4天数对饲料酸溶蛋白含量的影响2.2.5装料量对饲料中酸溶蛋白含量的影响（见图5）由图5可知，装料量达到50 g/250 g时酸溶蛋白含量最高，随着装料量的持续升高酸溶蛋白含量逐渐下降.因此最佳装料量选择为50 g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.018.F005图5装料量对饲料酸溶蛋白含量的影响2.2.6枯草芽孢杆菌与产朊假丝酵母添加比例对饲料中酸溶蛋白含量的影响（见图6）由图6可知，枯草芽孢杆菌与产朊假丝酵母添加比例为4∶1时酸溶蛋白含量最高，随着枯草芽孢杆菌的减少酸溶蛋白含量逐渐降低。因此确定最佳添加比例为4∶1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.018.F006图6枯草芽孢杆菌与产朊假丝酵母比例2.3响应面法分析参考上述不同发酵条件对饲料中酸溶蛋白含量的影响，选择较佳发酵温度、含水量、时间进行响应面试验分析，装料量设定为50 g/250 g、枯草芽孢杆菌与产朊假丝酵母添加比例为4∶1、接菌量8%。试验设计及结果见表2~表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.018.T002表2响应面试验设计水平A(温度)/℃B(含水量)/%C(天数)/d134562.5236583.0338603.510.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.018.T003表3响应面试验结果试验号ABC酸溶蛋白/%134603.05.42236562.56.18338583.56.27434583.55.53538582.55.56634582.55.43738563.06.15836603.55.58936583.06.81036583.06.841136583.06.591236583.06.651336602.55.531434563.05.951538603.05.551636583.06.61736563.56.3210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.018.T004表4回归方程方差分析方差来源平方和自由度均方F值P值模型4.18090.46022.1300.000 2A0.18010.1808.5700.022 1B0.79010.79037.7800.000 5C0.13010.1305.9500.044 8AB1.225×10-311.225×10-30.0580.816 1AC0.09310.0934.4300.073 4BC2.025×10-312.025×10-30.0960.765 3A21.35011.35064.3700.000 1B20.55010.55026.2300.001 4C20.78010.78037.3600.000 5残差0.15070.021失拟项0.09330.0312.2900.220 2纯误差0.05440.014总值4.33016由表4可知，本次试验该模型P0.05、失拟项P0.05，表明该二次回归方程合理且拟合度好。其中，发酵温度、含水量、发酵天数对酸溶蛋白的含量影响显著（P0.05），影响顺序为含水量发酵温度发酵天数。响应面图交互作用分析见图7~图9。由图7~图9可知，发酵温度和含水量、发酵温度和发酵时间、含水量和发酵时间交互作用对酸溶蛋白的含量影响均不显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.018.F007图7发酵温度和含水量的交互作用对饲料酸溶蛋白含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.018.F008图8发酵温度和发酵天数的交互作用对饲料酸溶蛋白含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.018.F009图9发酵天数和含水量的交互作用对饲料酸溶蛋白含量的影响3讨论酵母菌、芽孢杆菌等益生菌含有丰富氨基酸及有益因子，可以作为添加剂补充到发酵饲料中，同时可产生多种水解酶类促进饲料中大分子物质分解为可供动物吸收利用的小分子类化合物[14-15]。本试验选择枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌以及产朊假丝酵母作为试验菌株。结果显示，枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母混合发酵可明显提高饲料中酸溶蛋白含量，说明在本次试验条件下两菌株可协同发酵促进大分子蛋白水解。屈红森等[16]利用枯草芽孢杆菌对桑叶进行发酵，得出装液量105 mL、蔗糖质量浓度22 g/L、发酵时间45.1 h时桑叶蛋白得率和蛋白质含量分别提高10.57%和21.53%；亓秀晔等[13]利用乳杆菌和酵母菌发酵全价饲料，当料水比为1∶0.4、装袋量为100 g/袋、接种量2%、乳杆菌与酵母菌为3∶2和温度为30 ℃时酸溶蛋白含量高出对照组23.41%。本试验结果显示，发酵温度、含水量、发酵天数对酸溶蛋白的含量影响显著（P0.05），各发酵条件间相互作用不显著（P0.05）。当发酵温度36 ℃、含水量58%、发酵时间3 d时，酸溶蛋白比对照组提高26.7%（P0.05）。4结论本试验以饲料中酸溶蛋白的含量为指标，确定产朊假丝酵母与枯草芽孢杆菌混合发酵效果最佳。通过单因素及响应面试验对各因素及其交互作用进行分析，确定最佳发酵条件为：装料量50 g/250 g、菌种比例4∶1、接菌量8%、发酵温度36 ℃、含水量58%、发酵时间3 d。