病原微生物感染是造成腹泻的主要原因，其中以致病性大肠杆菌最常见。肠黏膜屏障是机体抵抗肠道病原体入侵的第一道防线，正常肠黏膜屏障具有防止病原侵入和维护肠道健康等功能。发生腹泻的机制是屏障功能受损后肠黏膜组织通透性增加，导致肠腔内细菌和内毒素等发生移位，引发机体脱水，电解质平衡被破坏，免疫力降低，进而引发全身炎症[1]。犊牛腹泻在集约化养殖中发病率高且极易造成死亡，是畜牧业中最常见和最具经济破坏性的疾病[2]。兽医临床多以抗生素治疗犊牛腹泻。但随着人畜共患病以及超变异细菌等抗残和耐药事件发生，寻找抗生素替代品迫在眉睫。在抗生素禁用、限用的趋势下，低毒副作用、低残留并且具有独特生物学作用等优点的中草药提取物逐渐受到关注，发挥着抗菌、抑菌、提高饲料利用率和改善动物肠道健康等功效。Silva等[3]研究表明，奶牛饲料中添加皂苷类植物提取物可提高泌乳奶牛的乳脂和蛋白质含量。Silva等[4]报道，在绵羊饲料中添加大蒜、芫荽种子、牛至和牧豆豆荚中的植物性提取物，可以促进绵羊消化吸收，有望开发为绵羊饲料添加剂。Long等[5]将刺五加提取物添加于肉鸡饲料中发现，刺五加提取物可以提高肉鸡生长性能，提高肠道免疫能力和抗氧化能力，促进有益菌生长。蒙药巴布-7（又名巴特尔-7）出自《手写验方》，已列入1998年《中华人民共和国卫计委药品标准·蒙药分册》。作为蒙医经典方药，蒙药巴布-7抗菌和消炎疗效显著[6]，能有效改善轻中度溃疡性结肠炎症状[7]，治疗急性腹泻效果比黄连素片更优[8]，对致犊牛腹泻病大肠杆菌的体外抑菌效果优于环丙沙星[9]。目前，关于巴布-7的研究仅局限于草药复方，其成分研究未见报道。且巴布-7复方在兽医临床上存在剂量大、操作不便等弊端。因此，本研究前期采用正交法筛选出巴布-7复方的抑菌抗炎成分复方基础上，拟以昆明系SPF小鼠为实验动物，通过灌服E. coli O8复制小鼠腹泻模型，探究巴布-7成分复方对腹泻小鼠屏障功能的影响。为巴布-7成分复方在犊牛腹泻治疗中发挥药用价值及作为饲料添加剂进行后续研究提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂巴布-7成分复方是课题组自制研发复方[10]。蒙兽药有效成分包括乳香酸、茜草素（上海士锋生物科技有限公司）、蒙花苷、β-谷甾醇（成都植标化纯生物技术有限公司）等。环丙沙星（广州白云山制药股份有限公司，产品批号：H23022275）。菌株：E. coli O8由课题组前期分离鉴定保存。白介素-4（IL-4）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、分泌型免疫球蛋白A（sIgA），检测试剂盒均购自厦门仑昌硕生物科技有限公司。1.2仪器设备多功能酶标仪（Synergy，上海迭戈生物科技有限公司）、石蜡切片机（YD-1508R，浙江金华益迪医疗设备厂）、光学显微镜（Olympus，上海光学仪器厂）。1.3试验方法1.3.1动物模型建立及给药方案（见表1）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.T001表1动物模型建立及给药方案组别小鼠数量/只造模方案给药方案NC组10对应UC组，灌胃等体积生理盐水灌胃生理盐水3 d，2 次/dUC组10灌胃2% NaHCO3 0.3mL，2 h后灌胃E .coli O8（109 CFU/ml）0.5 mL，1 次/d，连续灌胃3 d灌胃生理盐水3 d，2 次/dCIP组10同UC组灌胃环丙沙星0.50 mg/kg BW，灌胃3 d，2 次/dBSEIC.H组10同UC组灌胃BSEIC.H 1 g/kg BW，灌胃3 d，2 次/dBSEIC.M组10同UC组灌胃BSEIC.M 0.5 g/kg BW，灌胃3 d，2 次/dBSEIC.L组10同UC组灌胃BSEIC.L 0.25 g/kg BW，灌胃3 d，2 次/d60只SPF级昆明小鼠，雌、雄各半，体重（20±2）g，40日龄（购自内蒙古医科大学动物实验中心），于（25±2）℃、湿度40%~60%以及12 h明、12 h暗条件下适应性饲养3 d，每5只小鼠饲养于1笼中，饲以颗粒型维持饲料。造模结束后每1只小鼠饲养于1笼中，铺垫清洁滤纸，统计排便情况。末次给药后禁食不禁水24 h进行麻醉，心脏采血致死，4 ℃、3 000 r/min离心15 min取血清，-20 ℃保存。小肠取出后，生理盐水冲洗，使用生理盐水浸泡后纱布包裹，液氮速冻，80 ℃冰箱冻存。1.3.2小鼠稀便率与稀便指数的统计造模后与药物治疗后12 h统计每只小鼠的排便次数、稀便次数和稀便级数，计算腹泻率和腹泻指数。稀便指数用来描述每只动物稀便程度，以滤纸被稀便污染直径定级，分为4级：1级（1.0 cm）、2级（1.0～1.9 cm）、3级（2.0～3.0 cm）、4级（3.0 cm）。平均稀便级数=单只小鼠总稀便级数/稀便次数(1)腹泻率=腹泻小鼠数量/该组小鼠总数×100%(2)腹泻指数=稀便率×平均稀便级(3)1.3.3石蜡切片的制作、HE染色及PAS染色将多聚甲醛中固定好的组织块取出，脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋，制备4 μｍ厚切片进行HE染色和PAS染色。HE染色：经二甲苯及梯度酒精脱蜡，入苏木素染液染色15 min，盐酸-酒精分化2 min，自来水洗浸洗返蓝，伊红染色5 min，自来水洗浸洗30 s，梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、显微镜镜检拍照。PAS染色：脱蜡步骤与HE染色相同，1%过碘酸水溶液浸泡切片10 min，蒸馏水洗2 min。滴加Schiff氏试剂于切片组织上，室温避光孵育20 min，流水冲洗切片5 min，共2次。苏木素复染15 min，自来水冲洗至细胞核变蓝，无水乙醇脱水、二甲苯透明后中性树胶封片，显微镜镜检拍照。肠绒毛高度和隐窝深度的测量：每组选取4张切片，每张切片取10根笔直的绒毛测量其长度，绒毛高度为肠腺开口至绒毛顶端的垂直高度，隐窝深度为黏膜肌层至肠腺开口处的垂直高度；杯状细胞统计：每组选取4张切片，每张切片取10根笔直绒毛，采用Image-Pro Plus 6.0统计杯状细胞数量。1.3.4细胞因子的测定具体按照ELISA试剂盒说明书操作。1.3.5数据统计与分析采用SPSS 22.0 统计软件对数据进行单因素方差分析，采用最小显著差数法（LSD）检验，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1巴布-7对小鼠腹泻率和腹泻指数的影响（见表2）由表2可知，由E. coli O8所致各组腹泻小鼠腹泻率与腹泻指数差异不显著(P0.05)，经环丙沙星（CIP组）及BSEIC各剂量组治疗后各组腹泻率及腹泻指数低于模型组（UC组）(P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.T002表2巴布-7对小鼠腹泻率和腹泻指数的影响组别造模前造模后腹泻率%腹泻指数腹泻率/%腹泻指数UC组0.81a1.62a0.72a1.14aCIP组0.80a1.80a0.21b0.21bBSEIC.H组0.80a1.70a0.19b0.19bBSEIC.M组0.80a1.82a0.18b0.18bBSEIC.L组0.77a1.68a0.20b0.20b注：同列数据肩标字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05），小写字母不同表示差异显著（P0.05），大写字母不同表示差异极显著（P0.01）。2.2巴布-7成分复方对小鼠回肠组织病理结构的影响（见图1）由图1（a）可知，NC组肠绒毛结构完整，上皮细胞排列整齐、紧密，细胞间少量淋巴浸润，腺体结构未见异常，固有层密集未见损伤；由图1（b）可知，UC组观察到肠绒毛矮短、肠绒毛脱落、肠绒毛间隙增大、炎性细胞浸润、伴有水肿；由图1（c）可知，相对于UC组，CIP组绒毛形态得到很大程度恢复，肠绒毛排列相对整齐，细胞轮廓相对清晰；由图1（d）、（e）、（f）可知，BSEIC.H组、BSEIC.M组、BSEIC.L组肠绒毛均得到不同程度恢复，细胞排列有序、轮廓清晰、肠绒毛间隙缩小，其中BSEIC.M组和BSEIC.L组效果最好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.F001图1不同处理组小鼠回肠的黏膜组织结构（×200）2.2蒙药巴布-7成分复方对小鼠回肠绒毛高度和隐窝深度的影响（见图2）由图2可知，与NC组相比，UC组回肠绒毛长度显著降低（P0.05），CIP组、BSEIC.H组、BSEIC.M组和BSEIC.L组与UC组相比，回肠绒毛长度显著增高（P0.05）；UC组回肠隐窝深度极显著高于NC组（P0.05），与UC组相比，CIP组回肠隐窝深度显著降低（P0.05），BSEIC.H组、BSEIC.M组、和BSEIC.L组回肠隐窝深度极显著低于UC组（P0.01）；UC组回肠V/C值极显著低于NC组（P0.01），CIP组回肠V/C值显著高于UC组（P0.05），BSEIC.H组、BSEIC.M组和BSEIC.L组回肠V/C值极显著高于UC组（P0.01）。图2小鼠回肠绒毛高度与隐窝深度变化注：与UC组相比，*表示差异显著（P0.05），**表示差异极显著（P0.01）；与NC组相比，#表示差异显著（P0.05），##表示差异极显著（P0.01）；下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.F2a1（a）回肠绒毛长度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.F2a2（b）回肠隐窝深度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.F2a3（c）回肠V/C值2.3蒙药巴布-7成分复方对小鼠回肠杯状细胞数量及回肠sIgA的影响（见图3、图4）由图3、图4可知，UC组小鼠回肠杯状细胞数极显著低于NC组（P0.01），CIP组杯状细胞数量显著高于UC组（P0.05），BSEIC.H组、BSEIC.M组和BSEIC.L组杯状细胞显著高于UC组（P0.05），与CIP组差异不显著（P0.05），但BSEIC.H组、BSEIC.M组和BSEIC.L组间杯状细胞数量均有上升趋势。图3回肠杯状细胞数量与sIgA水平10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.F3a1（a）回肠杯状细胞数量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.F3a2（b）回肠sIgA水平10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.F004图4回肠PAS染色（×200）2.5蒙药巴布-7成分复方对小鼠炎性因子的影响（见图5）由图5可知，UC组血清中IL-6、TNF-α的含量极显著高于NC组（P0.01）；与CIP组相比，UC组血清TNF-α水平极显著降低（P0.01）；与UC组相比，BSEIC.H组、BSEIC.M组和BSEIC.L组血清IL-6、TNF-α显著降低（P0.05）。UC组血清IL-4、IL-10含量极显著低于NC组（P0.01），CIP组血清中IL-4、IL-10含量比UC组显著升高（P0.05），BSEIC.H组、BSEIC.M组、BSEIC.L组血清中均显著高于UC组(P0.05)，IL-4、IL-10的含量以BSEIC.M组最明显。图5腹泻小鼠血清中炎性因子的含量及回肠段sIgA含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.F5a1（a）IL-4含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.F5a2（b）IL-6含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.F5a3（c）IL-10含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.001.F5a4（d）TNF-α含量3讨论肠道是与外界接触最多的系统，总面积为200 m2，是消化器官和免疫器官。肠道接触食糜的同时也会接触大量细菌和毒素等[11]。因此，肠黏膜的屏障功能很重要，将肠道内容物从宿主组织中分离出来，调节营养吸收，并允许寄生菌群和黏膜免疫系统之间相互作用，抑制感染物质在内部组织中转移。腹泻率与腹泻指数可以反映小鼠腹泻情况。本试验以灌服制备E. coli O8腹泻小鼠模型以腹泻率及腹泻指数评价腹泻水平大致相同，经药物治疗后腹泻率及腹泻指数得到明显下降，显著低于UC组。完整黏膜是小肠发挥正常消化与吸收功能的结构基础，肠道黏膜结构被破坏是屏障功能受损的宏观表现。小肠绒毛长度与隐窝深度及二者比值可以反映肠道形态与功能，病理切片可以直观准确反映组织形态。故本研究先采用HE染色法观察致病性大肠杆菌入侵对小鼠回肠病理损伤的影响。结果显示，大肠杆菌入侵导致小鼠回肠绒毛变矮、肠绒毛脱落、绒毛间隙增大、炎性细胞浸润并轻度水肿，小鼠感染致病性大肠杆菌后肠道屏障受损。研究发现，小鼠感染E. coli O8会出现不同程度死亡，感染组小鼠小肠绒毛长度、V/C值显著降低、绒毛短小松散；大鼠腹腔注射E. coli O1 后，小肠绒毛短小并伴有水肿甚至出现绒毛和上皮细胞断裂脱落，与本研究结果相似[12]。蒙药巴布-7成分复方及抗生素治疗后小鼠回肠绒毛形态得到很大程度恢复，其中回肠绒毛排列整齐、细胞轮廓清晰、V/C比值显著升高，中计量组效果最好。试验表明，蒙药巴布-7成分及抗生素可缓解大肠杆菌对肠黏膜屏障损伤，降低腹泻引起的病死率。杯状细胞（GC）是一种高度极化的柱状上皮细胞，分布于哺乳动物消化道和呼吸道等，分布于肠道的杯状细胞对肠黏膜屏障具有重要作用[12-13]。主要分泌黏蛋白MUC2，是肠道黏液层的主要组成成分，黏液层在肠内容物与肠上皮细胞间发挥着润滑和缓冲屏障作用，是胃肠道抵御外来刺激第一道防线，杯状细胞直接决定着黏液质量[14]。通过PAS染色法观察小鼠回肠黏膜杯状细胞分布及数量，与健康小鼠相比，大肠杆菌入侵会导致小鼠回肠杯状细胞数量显著降低，着色变浅，有少量杯状细胞分布于绒毛基部。致病性大肠杆菌入侵会损伤杯状细胞增殖及发育。前期通过对小鼠腹腔注射牛源性E. coli O8，小鼠杯状细胞先减少后逐渐上升[15]。与本研究结果相似，腹泻小鼠用BSEIC.H、BSEIC.M、BSEIC.L及抗生素治疗后，回肠黏膜杯状细胞数量显著上升。试验表明，蒙药巴布-7成分复方及抗生素可抑制致病性大肠杆菌对杯状细胞损伤维持黏液更新，提高肠道屏障功能。肠道通过免疫细胞及细胞因子调节机体处于稳态，当肠道发生炎症时，细胞因子对于肠黏膜显示出重要的免疫调节作用。炎性因子主要由免疫细胞生成，介导多重免疫反应，TNF-α、IL-6作为促炎因子，是肠黏膜免疫应答紊乱的重要因素，参与炎症信号联放，使局部炎症持续存在，局部渗出增加，黏膜屏障持续受损，加重腹泻[16-17]。另一方面IL-4、IL-10等抗炎因子可以抑制炎症反应，研究表明，IL-4含量与肠道炎症水平相关，IL-10可通过抑制促炎因子等合成起到抑制炎症效果[18-19]。本试验通过ELISA方法探究致病性大肠杆菌入侵对机体炎性因子的影响，结果显示，小鼠灌胃E. coli O8一周后血清中促炎因子IL-6、TNF-α同对照组相比显著升高，抗炎因子IL-4和IL-10同对照组相比显著下降。药物治疗3 d后，以上指标都明显逆转，向正常组水平靠拢。试验表明，E. coli O8会导致小鼠体内促炎因子与抗炎因子失衡，引发炎症反应，BSEIC可以逆转这种局势。孙必强等[20]研究报道，七味白术散可以上调肠道IL-4、IL-10和下调IFN-α表达减轻肠道炎症，促进受损黏膜组织修复，与本试验结果一致。黏液中sIgA是肠黏膜免疫应答的主要效应因子，通过物理途径限制细菌增殖和移位，减少肠黏膜与病原体的接触，通过免疫反应中和肠内毒素，激活巨噬细胞发挥APC介导抗体依赖性，和细胞介导细胞毒作用（ADCC）机制杀灭肠道病原体，是保障肠内稳态的重要化合物。研究表明，肠道内有益菌能刺激肠黏膜产生sIgA，当致病菌占据优势时sIgA会下降[21]；鼠李糖乳杆菌DHC32可以显著提高小鼠肠黏膜sIgA含量[22]；植物乳杆菌可以缓解沙门菌引起的肠道损伤，刺激肠黏膜sIgA的分泌和改善肠道菌群结构[23]。本试验表明，与健康组相比，腹泻小鼠回肠中sIgA含量显著降低，因为致病性大肠杆菌的入侵损伤小鼠回肠黏膜中sIgA分泌。使致病性大肠杆菌损伤小鼠回肠中杯状细胞的增殖分化，导致sIgA分泌减少，减少对致病性大肠杆菌黏附、使致病菌穿越肠道屏障进入血液，引发腹泻或死亡。与致病性大肠杆菌会损伤杯状细胞的增殖与分化结果一致。药物治疗后，蒙药巴布-7成分复方及抗生素均能够有效提高sIgA含量，其中BSEIC.H组效果最优。研究表明，蒙药巴布-7成分复方可能通过提高杯状细胞数量及SIgA分泌来增加对致病性大肠杆菌黏附，缓解致病性大肠杆菌对小鼠肠道及机体造成的损伤，降低腹泻及死亡发生。4结论巴布-7成分复方可以通过提高肠道杯状细胞数量，平衡抗炎与促炎因子方式使小鼠肠道黏膜趋于完整，表明巴布-7成分复方在犊牛腹泻治疗中及作为饲料添加剂有开发潜力和应用前景。