梅山猪是我国优秀的地方猪种之一，具有高繁殖力、肉质好、耐粗饲和抗病力强等特性[1]。肠道微生物菌群早期建立和维持会影响猪后期健康和生长性能，而遗传背景、断奶、饮食、抗生素的使用和益生元添加等因素对仔猪肠道菌群多样性、结构和演替的建立至关重要[2-4]。腹泻可导致断奶仔猪死亡病，腹泻影响肠道菌群构成，而肠道菌群异常也容易引起腹泻。因此，本研究采集健康和腹泻梅山仔猪的粪便样本，利用16S rDNA测序技术研究不同时期粪便微生物菌群变化情况，旨在发现健康和腹泻时微生物菌群的主要特征，为养殖梅山仔猪提供参考。1材料与方法1.1试验材料追踪6窝梅山仔猪健康状况，于出生3、10、25 d采集仔猪粪便，每次取3份重复样品。健康仔猪编号方式为JK-窝号-出生天数。其中33、34和36号的三窝仔猪在16、14、10、17 d时出现腹泻，采集腹泻粪便，每次取3份重复样品。腹泻仔猪分别编号为FX-33-16、FX-34-1-14、FX-36-1-10、FX-36-1-17。JK表示健康，FX表示腹泻。1.2试剂与仪器D5625-02 Soil DNA Kit（基因组DNA提取试剂盒）购自Omega Biotek股份有限公司；ABI GeneAmp® 9700型PCR仪购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；HE-220电泳仪和Tanon 3 500全自动数码凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司；5 418 R台式高速冷冻离心机购自艾本德（上海）国际贸易有限公司。1.3试验方法1.3.1样品基因组DNA提取与16S rDNA PCR扩增根据Soil DNA Kit说明书提取各样品基因组DNA，设计引物341F（5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'）和806R（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'）进行PCR扩增。1.3.2测序与分析基于Illumina PE 250进行文库构建和测序，获得各样品读序（Reads）。按照97%相似性对序列进行OTU聚类，生成OTU表格。采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别以门（phylum）和属（genus），统计各样本的群落组成，获得每个OTU对应的物种分类信息。比对数据库为Silva（http://www.arb-silva.de）。采用Bray-Curtis算法进行相似性分析（Anosim）；使用LefSe软件来识别组间的差异物种，并使用线性判别分析（LDA）来估算每个物种丰度对差异效果的影响。2结果与分析2.116S rDNA测序结果以健康状况、窝号和出生天数记录和采集仔猪粪便样本，每个样本做3个重复，共获得66份样品，其中健康组54份，腹泻组12份。对样品提取总DNA，进行PCR扩增和16S rDNA测序，样本平均测序深度（Coverage）为0.995。测序完成后对读序（Reads）进行归类操作，相似性达到97%归为一类，即为1个OTU。2.2粪便微生物Alpha多样性对梅山仔猪腹泻的影响（见表1）由表1可知，比较健康组出生3、10、25 d的仔猪粪便微生物，其平均香浓指数（Shannon）随出生天数逐渐增大，平均辛普森指数（Simpson）随出生天数逐渐减小，说明微生物多样性随着梅山仔猪出生天数而逐渐变丰富。33、34和36号三窝仔猪在出生10 d左右出现腹泻，采集腹泻粪便进行测序。比较分析FX和JK-10的Shannon和Simpson指数，显示腹泻组较健康组的微生物群落多样性减小。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.017.T001表1粪便微生物Alpha多样性对梅山仔猪腹泻的影响组别样本编号读序相似性≥0.97OTU测序深度香浓指数（下限，上限）辛普森指数（下限，上限）JK-3JK-30-343 1351660.998 8872.590.127 1（2.57，2.6）（0.125 7，0.128 5）JK-31-344 3456510.995 7383.270.140 6（3.25，3.29）（0.138 3，0.142 9）JK-33-340 2373190.998 2113.20.096 0（3.18，3.21）（0.094 3，0.097 7）JK-34-347 9844390.996 9573.70.051 9（3.69，3.72）（0.051 0，0.052 8）JK-36-339 2654070.996 7663.60.070 7（3.58，3.61）（0.069 3，0.072 0）JK-39-336 7094210.996 5953.550.066 7（3.53，3.57）（0.065 5，0.067 9）平均值41 9464010.997 1923.320.092 2JK-10JK-30-1044 0564240.997 7984.030.036 0（4.01，4.04）（0.035 5，0.036 6）JK-31-1054 6264470.998 0054.190.030 3（4.17，4.2）（0.029 8，0.030 7）JK-33-1037 0505070.996 0324.040.039 6（4.02，4.05）（0.038 8，0.040 4）JK-34-1036 1604140.997 3173.970.044 3（3.95，3.98）（0.043 3，0.045 3）JK-36-1048 4465190.997 5234.470.023 4（4.46，4.48）（0.023 0，0.023 8）JK-39-1042 9755460.996 9284.550.018 8（4.53，4.56）（0.018 5，0.019 1）平均值43 8864760.997 2674.210.0320 7JK-25JK-30-25318438040.992 0234.460.037 9（4.44，4.49）（0.036 8，0.039 1）JK-31-25479597780.996 0174.510.044 4（4.49，4.53）（0.043 2，0.045 6）JK-33-2547 5447470.996 9924.920.015 3（4.91，4.94）（0.015 0，0.015 6）JK-34-2537 3325370.996 3844.250.031 2（4.23，4.26）（0.030 5，0.031 8）JK-36-2541 2259320.994 6155.160.012 8（5.14，5.17）（0.012 5，0.013 1）JK-39-2542 3407540.995 3944.360.037 3（4.34，4.37）（0.036 5，0.038 2）平均值41 3747590.995 2384.610.029 8FXFX-33-1649 1385210.998 4943.870.048 8（3.85，3.88）（0.048 0，0.049 5）FX-34-1-1449 0163160.998 1643.320.068 1（3.31，3.34）（0.067 2，0.069 1）FX-36-1-1042 3703920.997 5223.510.061 6（3.5，3.53）（0.060 5，0.062 6）FX-36-1-1745 2024810.996 9913.84（3.82，3.85）0.051 9（0.051 0，0.052 8 ）平均值46 4324280.997 7933.640.057 6注：Simpson和Shannon指数用来估算微生物的多样性。Simpson指数越大，多样性越低。Shannon指数越大，多样性越高。所有数据取自每个样本3个重复样品的平均值。2.3粪便微生物物种组成对梅山仔猪腹泻的影响健康组仔猪粪便微生物门水平组成见图1，健康组仔猪粪便微生物属水平组成见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.017.F001图1健康组仔猪粪便微生物门水平组成10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.017.F002图2健康组仔猪粪便微生物属水平组成由图1可知，JK组仔猪粪便微生物相对丰度最高的是厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）和梭杆菌门（Fusobacteria）。梅山仔猪从出生3 d至25 d，健康仔猪粪便中厚壁菌门丰度逐渐变高；变形菌门和梭杆菌门丰度逐渐降低；拟杆菌门丰度几乎保持一个较高的水平。由图2可知，JK-3组和JK-10组中拟杆菌属（Bacteroides）（分别为31%和20%）相对丰度最高；在JK-25组中，不同窝中丰度高的微生物略有不同，相对丰度较高的微生物有拟杆菌属（Bacteroides）、梭菌属（Fusobacterium）、Prevotellaceae NK3B31 group和普雷沃氏菌属（Prevotella 2）、Erysipelotrichaceae_uncultured。在23 d时，仔猪开始断奶，JK-25组中粪便微生物多样性改变可能与断奶和饮食改变有关。门水平主要微生物物种组成及相对丰度见表2。健康组与腹泻组仔猪粪便微生物门水平组成见图3，健康组与腹泻组仔猪粪便微生物属水平组成见图4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.017.T002表2门水平主要微生物物种组成及相对丰度组别厚壁菌门（Firmicutes）拟杆菌门（Bacteroidetes）变形菌门（Proteobacteria）梭杆菌门（Fusobacteria）平均读序总和JK-38 97110 7674 9764 81429 528JK-1012 68813 1081 9751 29229 063JK-2515 53310 3991 2171 17328 322FX14 75510 7261 4692 52529 47610.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.017.F003图3健康组与腹泻组仔猪粪便微生物门水平组成10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.017.F004图4健康组与腹泻组仔猪粪便微生物属水平组成由图3可知，厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和梭杆菌门相对丰度仍是最高。与JK-10组相比，梭杆菌门相对丰度显著提高（P0.05）。由图4可知，在属水平，与JK-10组相比，优势微生物发生变化。分析每窝腹泻粪便中的优势微生物，发现FX-33-16中丰度最高的是厌氧弧菌属（Anaerovibrio）（16%）；FX-34-1-14中相对丰度最高的是Shuttleworthia（27%）；FX-36-1-10中相对丰度最高的是乳杆菌属（Lactobacillus）（17%）；FX-36-1-17中相对丰度最高的是普雷沃氏菌属（Prevotella 2）（19%）。2.4梅山仔猪粪便微生物Beta多样性分析用Anosim分析结果显示R=0.680 25，R值接近1，表明组间差异大于组内差异；可信度P=0.001（P0.05），表示显著。将各组中有显著作用的微生物类群通过线性判别分析获得LDA值，统计LDA值大于4，P0.05的差异物种。健康组间LDA分析见图5。由图5可知，JK-3组中的主要差异微生物主要集中在变形菌门、梭杆菌门，JK-10组中主要差异微生物集中在拟杆菌门和厚壁菌门，而JK-25组的主要差异微生物是在厚壁菌门。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.017.F005图5健康组间LDA分析用Anosim检验健康和腹泻仔猪的差异，结果显示，R=0.777 78，R值接近1；可信度P=0.024（P0.05），表明组间具有显著差异。统计LDA值大于2.4，P0.05的差异物种，以科、属水平作图。健康组与腹泻组组间LDA分析见图6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.017.F006图６健康组与腹泻组组间LDA分析由图6可知，两组间差异的微生物主要集中在为拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门，广古菌门（Euryarchaeota）为JK组中的差异微生物。3讨论3.1健康梅山仔猪粪便微生物变化特征本研究追踪6窝哺乳期仔猪的健康状况，在3、10、25 d共采集54份健康仔猪粪便样品进行16S rDNA测序和菌群特征分析。健康样品共注释了18个门、35个纲、58个目、98个科、306个属和107个种，其中在种水平73.8%为不可培养微生物。Alpha多样性分析结果显示，随着出生天数增加，Simpson指数降低，而Shannon指数升高，说明菌群多样性增加，JK-3、JK-10和JK-25组有差异显著（P0.05）。而Beta多样性分析结果揭示每组主要差异的微生物，其中厚壁菌门随着出生天数增加差异越大。有研究表明，厚壁菌门是健康猪肠道第一大优势菌[5]。在哺乳阶段，梅山仔猪厚壁菌门升高，仔猪处于健康状态。分析不同出生天数健康仔猪粪便中微生物组成，发现健康组梅山仔猪粪便中变形菌门和梭杆菌门在25 d内逐渐下降，厚壁菌门逐渐升高，拟杆菌菌门处于较高丰度；拟杆菌属和梭菌属显著下降（P0.05），拟杆菌属S24-7和乳酸菌属显著提高（P0.05）。Yan等[4]发现厚壁菌门和拟杆菌门在杜洛克猪、长白猪、约克猪中都是优势菌，进一步说明厚壁菌门在维持仔猪健康中的重要作用。Jiang等[6]分析梅山仔猪在断奶48 h内结肠微生物区系微生物变化特征，发现拟杆菌属是哺乳期的主要微生物种群，与本研究结果基本一致，拟杆菌属在哺乳后期（25 d）丰度开始下降，可能与23 d时仔猪开始断奶有关。很多研究表明，在早期仔猪肠道微生物种类形成容易受到断奶、饮食变化、饲养方式和抗生素使用等因素影响[7-9]。通过分析研究梅山仔猪哺乳期到断奶期之间微生物菌群的变化，可以发现健康仔猪中，随着出生天数增加，仔猪肠道微生物多样性越来越丰富，厚壁菌门和拟杆菌门是优势菌。3.2腹泻梅山仔猪粪便微生物变化特征出生10~25 d之间，追踪3窝仔猪出现腹泻，仔猪腹泻影响成活率。因此，要预防仔猪腹泻，首先要了解仔猪肠道微生物变化情况。试验采集12份腹泻仔猪粪便样品进行16S rDNA测序和菌群特征分析。腹泻样品共注释了15门、29个纲、45个目、69个科、210个属和71个种。Alpha多样性分析结果表明，腹泻组与健康组相比，多样性显著下降（P0.05）。与JK-10组相比，腹泻组中梭杆菌门相对丰度增加95%左右，变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度变化不显著。在属水平，JK-10组中的厌氧弧菌属（Anaerovibrio）相对丰度仅为27，而在腹泻组中，相对丰度为2602。并且，其他菌群拟普雷沃菌属（Alloprevotella）、拟杆菌属（Bacteroidales S24-7 group_norank）、梭杆菌属（Fusobacterium）、乳杆菌属（Lactobacillus）、普雷沃菌属（Prevotella 2）、Prevotellaceae NK3B31 group和Shuttleworthia比JK-10组丰度显著增加（P0.05），但埃希氏-志贺菌属（Escherichia-Shigella）却下降，与特日格勒等[10]的研究有一定差异，可能与仔猪的品种、日龄、遗传背景以及饲养环境等因素有关。动物肠道内存在着种类繁多，数量不一的微生物区系，这些微生物区系对动物健康至关重要[11]。随着分子生物学和组学技术发展，猪胃肠道中微生物区系逐渐得到更深入研究。在猪肠道中，主要微生物有细菌、真菌和病毒等，其中细菌占绝对优势[12]。4结论文章通过16S rDNA高通量测序技术，对优秀地方种猪梅山仔猪开展研究，分析和比较哺乳期健康和腹泻仔猪粪便微生物群落的变化特征，发现哺乳期梅山仔猪发生腹泻的原因可能是肠道中梭杆菌门微生物的相对丰度增加，打破肠道微生物生态系统的平衡，导致免疫力下降，引起仔猪腹泻。