饲料中富含多种维生素等营养物质，一些成分可能会在运输储存过程中被氧化。因此，许多企业在饲料中添加抗氧化剂，用来延长产品保质期及新鲜度[1-3]。丁基羟基茴香醚（BHA）可以抑制黄曲霉菌生长[4]，二丁基羟基甲苯（BHT）适合高油脂含量饲料长期保存[5]。但是，BHA、BHT等抗氧化剂会通过生物富集或食物链传递威胁人类健康[6]。因此，我国的农业农村部公告第2625号《饲料添加剂安全使用规范》[7]对饲料中抗氧化剂的限量做出规定，并发布国家标准《饲料中丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、乙氧喹和没食子酸丙酯的测定》（GB/T 17814—2011）[8]来规范饲料中抗氧化剂的安全使用。当检验检测机构按照国标方法得到的结果为边缘值时，需要通过此方法的不确定度进行科学判定。不确定度是根据所用到信息，表征赋予被测量量值分散性的非负参数[9]。在检测过程中，不确定度可能会对规范限度的符合性产生影响[10]。因此，对于饲料行业关注的检测标准，均有相关不确定度分析报道[11-13]。GB/T 17814—2011规定的检测方法分为气相法和液相法，其中液相方法为仲裁法。但是，目前没有对该仲裁法不确定度研究。本研究采用国标方法对预混合饲料中的BHA和BHT进行测定，分析并量化测定过程中各不确定度分量，进一步得到合成标准不确定度及扩展不确定度。通过分析，找出对测定结果影响较大的因素，为饲料中抗氧化剂的测定结果提供参考。1材料与方法1.1仪器与试剂2695型高效液相色谱仪配二极管阵列检测器（美国Waters公司）、2300 TH型超声波提取仪（中国安谱生物科技公司）、AL 104型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）、Molatom 1810 A型制水机（中国Molecular公司）、BHA及BHT对照品（中国振翔科技公司）。乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；乙酸（分析纯，中国凌峰化学试剂公司）；测定的饲料样品为市售预混合饲料；试验用水均为符合GB/T 6682[14]规定的一级水；玻璃量器均为A级。1.2试验方法按照国家标准《饲料中丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、乙氧喹和没食子酸丙酯的测定》（GB/T 17814—2011）[8]的要求，测定样品中的BHA及BHT。1.2.1样品溶液的配制准确称取样品5 g，置250 mL具塞三角瓶中，准确加入50 mL乙腈，摇匀，超声提取40 min，期间振摇2次。取出，冷却至室温后，过滤膜得到样品溶液，待测。1.2.2混合标准储备溶液的配制准确称取BHA及BHT对照品250 mg于250 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀；准确移取该溶液20 mL，置于200 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，得到混合标准储备溶液。1.2.3混合标准工作溶液的配制准确移取混合标准储备溶液0.5、2.0、4.0、8.0、16.0、20.0和25.0 mL置于50 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，得到混合标准工作溶液，使浓度分别为1、4、8、16、32、40和50 μg/mL。1.2.4液相色谱条件流动相为乙腈∶2%乙酸=68∶32；C18色谱柱，长150 mm、内径3.9 mm、粒径5 μm；流速为0.5 mL/min；柱温为25 ℃；进样量为20 μL；检测波长为280 nm。2数学模型和不确定度来源分析2.1计算含量的数学模型X=c×V×Dm (1)式中：X为样品中BHA或BHT的含量（mg/kg）；c为通过标准曲线方程得到的样品中的BHA或BHT的浓度（μg/mL）；V为样品定容体积（mL）；m为样品质量（g）。2.2不确定度来源分析根据数学模型、实验过程及原理的分析，不确定度的来源主要有：样品前处理产生的不确定度；混合标准工作溶液的浓度产生的不确定度；标准曲线引入的不确定度；方法重复性产生的不确定度及方法回收率产生的不确定度。3不确定度分量的评定3.1样品前处理产生的不确定度该不确定度来源于样品的称量和样品的提取。3.1.1样品的称量引起的不确定度试验中，样品称量为2 g，精确至0.000 1 g，根据使用天平的检定证书所示，天平的最大称量Max为110 g，示值的最大允许误差在0~50 g区间内为±0.5 mg，按照均匀分布计算，即k=3，则天平的称量误差为u1m样=0.000 53=2.89×10-4。依据《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS-GL0006：2019）[15]的规定，批次变化（称量重复性）引入的不确定度为0.5×最后一位有效数字，天平实际分度值d为0.1 mg，因此得到重复性的不确定度为：u2m样=0.5×0.1=0.05 mg=5×10-5。各分量独立不相关，故合并两项得到样品称量引起的标准不确定度为Um样=u1m样2+u2m样2=(2.89×10-4)2+(5×10-5)2=2.93×10-4 g。相对不确定度为：Urelm样=Um样m样×100%=1.46×10-4%。3.1.2样品的提取引起的不确定度样品提取过程中，需要使用50 mL分度吸量管，依据《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）要求[16]，其容量允差为±0.10 mL，按照均匀分布计算，即k=3，则不确定度为u1v样=0.103=5.77×10-2 mL。样品的提取剂为乙腈，实验室温度为（20±5）℃，乙腈的膨胀系数为1.37×10-3（1/℃）[17]，故产生的体积变化为1.37×10-3×5×50＝3.43×10-1 mL。按照均匀分布计算，即k=3，则不确定度为u2v样=3.43×10-13=1.98×10-1 mL。重复吸取50 mL液体，连续10次进行称量试验，得到标准偏差为5.27×10-3 mL，即重复性不确定度为u3v样=5.27×10-3 mL。各分量独立不相关，合并各项得到样品的提取引起的标准不确定度为：Uv样=u1v样2+u2v样2+u3v样2=(5.77×10-2)2+(1.98×10-1)2+(5.27×10-3)2=2.06×10-1 mL。相对不确定度为Urelv样=Uv样v样×100%=4.12×10-1%。3.2标准系列溶液的浓度产生的不确定度该不确定度来源于对照品的纯度，对照品的称量及标准系列溶液的配制。3.2.1对照品的纯度引起的不确定度根据BHA对照品证书所示，其纯度为97.4%±3.0%，按照均匀分布计算，即k=3，则不确定度为Up标BHA=3.03=1.73%。相对不确定度为Urelp标BHA=u1p标BHAp标BHA×100%=1.78%。根据BHT对照品证书所示，其纯度为100%±3%，按照均匀分布计算，即k=3，则不确定度为Up标BHT=33=1.73%。相对不确定度为Urelp标BHT=u1p标BHTp标BHT×100%=1.73%。3.2.2对照品的称量引起的不确定度试验中，BHA对照品称量为250 mg，精确至0.000 1 g，根据使用天平的检定证书所示，本天平的最大称量Max为110 g，示值的最大允许误差在0~50 g区间内为±0.5 mg，按照均匀分布计算，即k=3，则天平的称量误差为u1m标BHA=0.000 53=2.89×10-4 g。依据《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS—GL0006：2019）[15]的规定，批次变化（称量重复性）引入的不确定度为0.5×最后一位有效数字，本天平实际分度值d为0.1 mg，因此得到重复性的不确定度为u2m标BHA=0.5×0.1=0.05 mg=5×10-5 g。各分量独立不相关，故合并两项得到样品称量引起的标准不确定度为：Um标BHA=u1m标BHA2+u2m样标BHA2=(2.89×10-4)2+(5×10-5)2=2.93×10-4 g。相对不确定度为Urelm标BHA=Um标BHAm标BHA×100%=1.17×10-1%。BHT对照品称量与BHA一致，使用的天平一致，故Um标BHT= Um标BHA=2.93×10-4 g，Urelm标BHT=Urelm标BHA=1.17×10-1%。3.2.3标准系列溶液的配制引起的不确定度该不确定度来源于混合标准储备溶液的配制和混合标准工作溶液的配制。3.2.3.1混合标准储备溶液的配制引起的不确定度主要是对照品用乙腈稀释，定容至250 mL时引起的不确定度及再次稀释10倍引起的不确定度。（1）依据《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）要求[16]，250 mL容量瓶的容量允差为±0.15 mL，按照均匀分布计算，即k=3，则不确定度为：u1v标=0.153=8.66×10-2 mL。对照品的溶剂为乙腈，实验室温度为（20±5）℃，乙腈的膨胀系数为1.37×10-3（1/℃）[17]，故产生的体积变化为：1.37×10-3×5×250＝1.71 mL。按照均匀分布计算，即k=3，则不确定度为：u2v标=1.713=9.87×10-1 mL。连续10次进行定容称量试验,得到标准偏差为1.27×10-2 mL，即重复性不确定度为u3v标=1.27×10-2 mL。各分量独立不相关，故合并各项的对照品溶解定容250 mL的标准不确定度为：Uv标250=u1v标2+u2v标2+u3v标2=(8.66×10-2)2+(9.87×10-1)2+(1.27×10-2)2=9.91×10-1 mL。相对不确定度为Urelv标250=Uv标250v标250×100%=3.96×10-1%。（2）再次稀释10倍的过程中，使用25 mL分度吸量管移取20 mL，置于200 mL容量瓶中。依据《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）要求[16]，25 mL分度吸量管和200 mL容量瓶的容量允差分别为±0.10 mL及±0.15 mL，按照均匀分布计算，即k=3，则不确定度分别为u4v标=0.103=5.77×10-2 mL及u5v标=0.153=8.66×10-2 mL。稀释溶剂为乙腈，实验室温度为（20±5） ℃，乙腈的膨胀系数为1.37×10-3（1/℃）[17]，故产生的体积变化分别为1.37×10-3×5×25＝1.71×10-1 mL及1.37×10-3×5×200＝1.37 mL。按照均匀分布计算，即k=3，则不确定度分别为：u6v标=1.71×10-13=9.87×10-2 mL及u7v标=1.373=7.91×10-1 mL。连续10次进行排出及定容称量试验，得到标准偏差分别为6.33×10-3 mL及3.03×10-2 mL，即重复性不确定度为：u8v标=6.33×10 -3 mL及u9v标=3.03×10-2 mL。各分量独立不相关，故合并各项的25 mL分度吸量管的标准不确定度为：Uv标25=u4v标2+u6v标2+u8v标2=(5.77×10-2)2+(9.87×10-2)2+(6.33×10-3)2=1.15×10-1 mL。相对不确定度为Urelv标25=Uv标25v标25×100%=4.60×10-1%。200 mL容量瓶的标准不确定度为：Uv标200=u5v标2+u7v标2+u9v标2=(8.66×10-2)2+(7.91×10-1)2+(3.03×10-2)2=8.45×10-1 mL。相对不确定度为：Urelv标200=Uv标200v标200×100%=4.22×10-1%。由此得到混合标准储备溶液的配制引起的相对不确定度为：Urelv标储备=Urelv标2502+Urelv标252+Urelv标2002=(3.96×10-1%)2+(4.60×10-1%)2+(4.22×10-1%)2=7.39×10-1%。3.2.3.2混合标准工作溶液的配制引起的不确定度根据标准文本要求，配置过程共需要1、5、10、25 mL四种分度吸量管和50 mL棕色容量瓶。引用3.2.3.1（2）的结果，得到25 mL吸量管的相对不确定度为4.60×10-1%。依据《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）要求[16]，查得1、5、10 mL三种分度吸量管的容量允差分别为±0.008、±0.025及±0.05，50 mL容量瓶的容量允差为±0.05 mL。稀释溶剂为乙腈，实验室温度为（20±5）℃，乙腈的膨胀系数为1.37×10-3（1/℃）[17]，可得到各自温度引起的不确定度。通过连续核查10次得到的排除体积的标准偏差计算得到重复性引起的不确定度。分别计算各分量的合成不确定度和合成相对不确定度，得到标准系列溶液的配制引起的相对不确定度Urelv标工作，见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.025.T001表1混合标准工作溶液的配制引起的不确定度量具（数量）1 mL分度吸量管5 mL分度吸量管10 mL分度吸量管25 mL分度吸量管50 mL容量瓶Urelv标工作/%1.11校准不确定度（k=3，mL）4.62×10-31.44×10-22.89×10-25.77×10-22.89×10-2温度效应（k=3，mL）3.95×10-31.98×10-23.95×10-29.87×10-21.97×10-1重复性变化（n=10，mL）1.35×10-31.24×10-35.16×10-36.33×10-34.83×10-3合成不确定度/mL6.23×10-32.45×10-24.92×10-21.15×10-11.99×10-1合成相对不确定度/%6.23×10-14.90×10-14.92×10-14.60×10-13.98×10-1由此，得到标准系列溶液的配制引起的相对不确定度为：Urelv标配制=Urelv标储备2+Urelv标工作2=(7.39×10-1%)2+(1.11%)2=1.33%。3.3标准曲线产生的不确定度对标准工作溶液进行测定，每个浓度重复测定3次，计算各浓度峰面积的平均值并绘制浓度-面积标准曲线，同时对样品溶液进行平行测定6次，得到的具体数据见表2、表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.025.T002表2标准工作溶液浓度及相应的峰面积标液浓度/(μg/mL)14816324050BHA的峰面积32 112125 879249 240513 5861 016 9001 264 2421 582 27732 337125 327249 415513 0221 016 2811 264 1431 581 89331 856126 018249 036513 8461 016 6431 264 2941 582 975面积均值32 102125 741249 230513 4851 016 6081 264 2261 582 382BHT的峰面积22 92984 562174 354355 682704 250898 7361 129 95723 20784 036174 916355 964704 133899 1461 129 06323 05184 711173 671355 218704 611898 4541 129 725面积均值23 06284 436174 314355 621704 331898 7791 129 58210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.025.T003表3标准曲线拟合方程及相关参数对照品方程斜率截距相关系数BHAy=31 660.829 8x+426.957 931 660.829 8426.957 91.000 0BHTy=22 559.955 1x-5 204.030 922 559.955 15 204.030 90.999 8通过计算标准曲线残差的标准差、样品中目标物的含量均值，得到标准曲线引入的不确定度。其中，标准曲线残差的标准差根据公式（2）计算：s(A)=∑i=1n(Ai-Yi)2n-2 (2)标准曲线引入的不确定度根据公式（3）计算：Uc标曲=s(A)a×1n+1N+(C样¯-X¯)2∑i=1n(Xi-X¯)2 (3)式中：Ai为标准工作溶液第i次测定的实际峰面积；Yi为标准工作溶液第i次测定相应的理论峰面积；n为标准溶液测定次数(n＝7×3＝21)；a为标准曲线的斜率；N为样品平行测定的次数(N＝6)；C样¯为样品溶液中BHA或BHT的平均浓度，分别为21.14和20.52 μg/mL；Xi为第i次测定的拟合浓度；X¯为标准工作溶液的平均质量浓度为21.57 μg/mL。将表2、表3中的数据代入，得到sABHA＝3 593.39，sABHT＝6 110.98，进一步得到Uc标曲BHA=5.25×10-2 μg/mL，Uc标曲BHT=1.25×10-1 μg/mL。则BHA和BHT通过标准曲线引入的相对不确定度分别为Urelc标曲BHA=5.25×10-221.14×100%=2.48×10-1%，Urelc标曲BHT=1.25×10-120.52×100%=6.09×10-1%。3.4方法重复性产生的不确定度对饲料样品平行测定6次，根据公式（4）计算：Uc重=∑i=1n(Xi-X¯)2n(n-1) (4)式中：n为测定次数；Xi为第i次测定值；X¯为测定平均值。代入表4数据，得到：UcBHA重＝2.74×10-1 mg/kg，UcBHT重＝2.11×10-1 mg/kg。样品测定的重复性引起的相对不确定度为UrelcBHA重=2.74×10-1523.3×100%=5.24×10-2%，UrelcBHT重=2.11×10-1507.8×100%=4.16×10-2%。3.5方法回收率产生的不确定度根据表4中样品的含量平均值，进行相应浓度的加标，平行测定6次，具体数据见表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.025.T004表5回收率试验结果编号BHABHT加标量/(mg/kg)回收率/%平均回收率/%加标量/(mg/kg)回收率/%平均回收率/%1502.197.3896.2503.894.1895.02502.196.34503.895.643502.196.16503.895.364502.195.53503.894.865502.196.02503.895.356502.195.61503.894.77采用单个样本t检验，考察平均回收率和指定值100%的差异性，设定显著水平为0.05，采用SPSS 20.0得到Sig.（2-tailed）小于0.01，表示差异极显著，因此本方法需考虑回收率引起的不确定度。根据公式（5）计算：Uc回=∑i=1n(Xi-X¯)2n(n-1) (5)式中：n为测定次数；Xi为第i次的回收率；X¯为回收率的平均值。代入表5数据，得到：UcBHA回＝2.73×10-1%，UcBHT回＝2.17×10-1%。进一步得到样品测定的回收率引起的相对不确定度为：UrelcBHA回=2.73×10-196.2×100%=2.84×10-1%。UrelcBHT回=2.17×10-195.0×100%=2.28×10-1%。4不确定度的合成及结果4.1合成相对标准不确定度为了便于观察及计算，将上述测定BHA及BHT的不确定度分量各分量的相对标准汇总，见表6。通过柱状图的方式直观表现测定过程中各个分量对不确定度的贡献大小，见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.025.T005表6测定BHA及BHT的各不确定度分量不确定度的分量BHA分量值/%BHT分量值/%样品称量1.46×10-41.46×10-4样品提取4.12×10-14.12×10-1对照品纯度1.781.73对照品称量1.17×10-11.17×10-1标准溶液的配制1.331.33标准曲线2.48×10-16.09×10-1方法重复性5.24×10-24.16×10-2方法回收率2.84×10-12.28×10-110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.11.025.F001图1相对不确定度的分量分布图由图1可知，对照品相关的分量对不确定度的贡献最大，分别为对照品的纯度、标准溶液的配制以及标准曲线。这对对照品的选择、标准贮备溶液及标准工作溶液的配制、使用和存放等方面均提出了较高要求，需要科学规范地使用容量瓶、吸量管等量器，并选择纯度更高的对照品。此外，样品提取和对照品的称量的贡献度也较大。因此，需要正确使用电子天平，并关注其工作状态。方法的回收率和重复性也不容忽视，两者可以考察样品的提取效率、试验人员的操作水平和仪器设备工作状态等。由表6可知，测定BHA的合成相对标准不确定度为：UrelBHA=Urelm样2+Urelv样2+Urelp标BHA2+Urelm标BHT2+Urelv标配制2+Urelc标曲BHA2+UrelcBHA重2+UrelcBHA回2=2.29%。测定BHT的合成相对标准不确定度为UrelBHT=Urelm样2+Urelv样2+Urelp标BHA2+Urelm标BHT2+Urelv标配制2+Urelc标曲BHA2+UrelcBHA重2+UrelcBHA回2=2.32%。4.2合成标准不确定度根据本方法测定得到的样品中BHA、BHT的含量及4.1的结果，得到BHA的合成标准不确定度为UBHA =523.3×2.29%=11.98 mg/kg。BHA的合成标准不确定度为UBHT =507.8×2.32%=11.78 mg/kg。4.3扩展不确定度取包含因子k=2，根据4.2的结果，得到BHA的扩展不确定度为：UkBHA=2×11.98=23.96 mg/kg。BHT的扩展不确定度为：UkBHT=2×11.78=23.56 mg/kg。4.4测量不确定度的结果根据本方法测定得到的样品中BHA、BHT的含量及4.3的结果，得到本方法测得饲料样品中BHA的含量为523.3 mg/kg，k=2；BHT的含量为507.8 mg/kg，k=2。5结论检测人员在使用本标准测定饲料中BHA及BHT时，需要留意标准溶液的配制及对照品纯度的选择，对照品准备溶液需严格保存并进行期间核查，相关的仪器设备的也要定期进行检定和核查。还应定期进行人员及仪器比对，尽可能降低各个分量的影响，是检测结果准确可靠。