聚乳酸(PLA)作为一种价格低廉、具有良好的可降解性和可加工性的环境友好型高分子塑料，已被用于可吸收性平板、手术缝合线、植入性支架以及药物递送载体等生物医学领域[1-2]。近年来，PLA基血液透析膜的研发引起科研人员的注意。由于PLA作为一种弱聚电解质，亲水性较差，血液中废弃物质很容易通过疏水或静电相互作用吸附膜材表面，造成一系列不良反应，阻碍PLA作为血液透析膜的进一步应用[3]。改善PLA基血液透析膜性能的关键是提高材料的生物相容性和抗生物污染性[4-5]。目前，对于PLA膜材料常用的改性方法可分为表面改性[4, 6-7]和共混改性[8]。无机纳米粒子尤其是氧化石墨烯(GO)具有热稳定好、无毒、易溶于水等优点，可用于PLA的共混改性，提高复合膜的亲水性和生物相容性[9-12]。本实验通过非溶剂诱导相分离技术制备一种价格低廉、操作方便的PLA/GO复合膜，探究不同掺杂量的GO对PLA膜热稳定性、孔隙率、亲水性和水通量的影响，进一步评价PLA/GO膜材料的细胞毒性和血液相容性。1实验部分1.1主要原料聚乳酸(PLA)，Mw=26 000，山东岱钢科技有限公司；氧化石墨烯(GO)，直径3 µm，厚度为0.55~1.2 nm，北京德科岛金科技有限公司；凝血酶原(PT)试剂盒，上海双赢生物科技有限公司；小鼠胚胎成骨细胞，MC3T3-E1、小鼠成纤维细胞培养基，L929，上海研生实业有限公司；DMEM培养基、鞣花酸(95%)、胰蛋白酶、3(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)，纯度99%，美国Sigma-Aldrich公司；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、甲醇(MeOH)、氯化钙，分析纯，成都科隆试剂有限公司。1.2仪器与设备场发射扫描电镜(SEM)，JSM-IT800SHL，日本电子株式会社；热重分析仪(TG)，TGA-601，南京汇成仪器仪表有限公司；万能试验机，34SC05，美国英斯特朗公司；X-射线衍射仪(XRD)，D8-Discover，德国布鲁克公司；自动涂膜机，CHTB-02，济南初创机电有限公司；接触角仪，JC200D1，瑞典佰欧林科技有限公司；集热式恒温加热磁力搅拌器，DF-101S，巩义市予华仪器有限公司；超声波清洗器，KQ250-B，昆山超声仪器有限公司；酶标仪，Varioskan LUX，赛默飞世尔科技有限公司；半自动凝血仪，PUN-2048A，北京朗普新技术有限公司。1.3样品制备采用非溶剂诱导相分离法制备PLA/GO复合膜。以PLA/GO-0.25制备为例，将0.25 g GO加入79.75 g NMP溶液中超声3 h，向上述溶液加入20 g PLA，80 ℃油浴中搅拌溶解。将脱泡后的铸膜液倒入模具中，用自动涂膜机制得厚度为200 µm的膜。将预成膜样品室温水浴固化后，真空干燥24 h，待溶剂挥发干净后，将所得膜切成1 cm×1 cm，备用。采用上述制备方法，通过调整GO的用量制得GO含量分别为0、0.1%、0.25%和0.5%的PLA/GO复合膜，表1为PLA/GO铸膜液配方组成。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.06.010.T001表1PLA/GO铸膜液配方组成Tab.1Formula composition of PLA/GO casting solution样品PLAGONMPPLA20.00080.00PLA/GO-0.120.000.1079.90PLA/GO-0.2520.000.2579.75PLA/GO-0.520.000.5079.50%%1.4性能测试与表征SEM分析：对样品表面喷金处理，观察膜的表面形貌。XRD测试：以Cu Kα为辐射源，扫描范围5°~50°，扫描速度2 (°)/min。TG测试：N2气氛，加热速率10 ℃/min，测试范围为30~600 ℃。拉伸强度测试：拉伸速率为20 mm/min。孔隙率测试：通过干湿重法测量PLA/GO膜的孔隙率。孔隙率的计算公式为：ε=Mw-MdS×h (1)式(1)中：ε为孔隙率，%；Mw和Md分别为膜湿重和干重，g；S为膜表面积，m2；h为膜厚度，m。水接触角测试：测定2 µL水滴落在PLA/GO膜表面后1 min内的水接触角浮动。水通量测试：将PLA/GO膜置于超滤杯中注满水后密封。在0.2 MPa下将膜预压25 min，待水通量基本稳定后，收集0.1 MPa下5 min时间内透过膜的溶液体积，水通量的计算公式为：J=VA∙t (2)式(2)中：J为水通量，L/(m2·h)；t为过滤时间，h；A为膜有效表面积，m2；V为t时间过滤水体积，L。细胞毒性测试：按GB/T 16886.5—2017进行测试，将PLA/GO膜以5 cm2/mL的比例，37 ℃浸泡在RPML1640 培养基中，浸提24 h后备用。同等条件下浸提滤纸片做阴性对照组。采用MTT法评估PLA/GO膜对小鼠胚胎成骨细胞(MC3T3-E1)和小鼠成纤维细胞(L929)的细胞毒性。以L929细胞毒性测试为例，在DMEM培养基中加入相对于培养基体积10%的胎牛血清(FBS)和1%青霉素-链霉素溶液配置完全培养基。将复苏L929细胞传代1~2代，将处于对数增长期的细胞以每孔5 000~8 000个细胞的密度接种在96孔板中，培养箱中过夜，待细胞完全贴壁后，将PLA/GO浸提液、阴性对照组和空白对照组(每组n=5)分别添加到96孔板中。继续孵育48 h后，吸出培养基，并用PBS洗涤后，分别加入100 mL的完全培养基和10 µL MTT到每个孔中，继续培养4 h。吸出培养基用PBS洗涤残留的MTT，向每个孔中加入100 µL DMSO，振荡10 min 以充分溶解甲臜。使用酶标仪测定溶液在540 nm波长处吸光度。细胞存活率的计算方程式为：细胞存活率（%）=ODtreat-ODblankODcontrol-ODblank×100%(3)活化部分凝血活酶时间(APTT)测试：取30 mL健康人全血1 000 r/min离心15 min，收集贫乏血小板血浆备用。将1 cm×1 cm纯PLA膜和不同GO质量分数的PLA/GO膜置于48孔细胞培养皿，每孔中加入0.2 mL贫乏血小板血浆和0.2 mL鞣花酸，室温浸润10 min。每组加入0.02 mol/L的NaCl 0.2 mL，振荡均匀，测定材料的APTT值。凝血酶原时间(PT)测试：将纯PLA膜和不同GO质量分数的PLA/GO膜置于48孔细胞培养皿，37 ℃每孔加入0.2 mL贫乏血小板血浆，培养20 min后，每孔加入0.2 mL的标准PT试剂，测定不同材料的PT值。2结果与讨论2.1PLA/GO膜SEM分析图1为掺杂不同含量GO的PLA/GO血液透析膜表面形貌SEM照片。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.06.010.F001图1不同含量GO的PLA/GO血液透析膜表面形貌SEM照片Fig.1SEM images of the surface morphology of PLA/GO hemodialysis membranes with different content of GO从图1可以看出，纯PLA膜表面相对光滑。当GO的含量从0.1%逐渐增大到0.25%时，PLA/GO膜表面相对光滑且孔隙率增大。GO含量继续增加，膜材料表面呈现凹凸不平的粗糙结构。PLA/GO膜材料表面结构的变化与相分离过程相关[13]。GO含量较低时，NMP(11.5)和PLA(10.5)的溶度参数差别较大[14]，由于铸膜液为亚稳态，掺杂高亲水性的GO能够促使水进入铸膜液内，更容易发生瞬时相分离，有利于孔结构的形成。随着GO含量的增大，铸膜液黏度明显增大，此时溶液黏度主导相分离过程，溶剂逸出困难孔结构不易形成，过量的GO在弱相互作用力的驱动下聚集在PLA/GO膜表面。2.2PLA/GO膜XRD分析图2为GO、PLA和PLA/GO-0.25膜的XRD谱图。从图2可以看出，在11.3°处显示GO特征衍射峰。PLA的特征衍射峰在15°、17°、19°处，峰形尖锐。PLA/GO-0.25膜的XRD谱图与PLA膜相似，但复合膜的特征峰峰形较宽强度减弱，这可能是由于GO在PLA基体中产生微应力，阻碍PLA分子链段排列，导致结晶度下降所致。PLA/GO-0.25膜在11.3°处存在较弱的GO特征峰，表明GO成功加入PLA膜。GO峰强度减弱主要是由于其在复合材料中含量较低，在PLA基材中分散性较好。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.06.010.F002图2GO、PLA、PLA/GO-0.25的XRD谱图Fig.2XRD patterns of GO， PLA， PLA/GO-0.252.3PLA/GO膜TG曲线和拉伸强度分析图3为掺杂GO的PLA膜的TG曲线和拉伸强度测试。从图3a可以看出，纯PLA膜在低于240 ℃质量略有下降，这是由于PLA中吸附的部分水蒸发。PLA膜在240 ℃开始分解，PLA发生分子链的断裂和降解，360 ℃基本分解完全，分解速率比较均匀。PLA/GO-0.25膜在270 ℃开始分解，370 ℃分解完全。PLA/GO-0.25膜的初始分解温度与PLA相比提高约30 ℃，这是因为GO与PLA分子间具有弱相互作用力，在PLA分解时吸收部分能量。片状的GO掺杂在PLA膜中，增大PLA降解物的扩散路径，延缓PLA膜的降解速度。从图3b可以看出，随着GO含量的增加，PLA/GO拉伸强度逐渐增大，且幅度较小。PLA/GO-0.25膜拉伸强度为34 MPa，与纯PLA膜相比增大1.7倍。PLA/GO拉伸强度增大与GO具有较大的断裂强度和弹性模量有关。另外，GO表面含氧基团与PLA产生氢键或者范德华力作用力对膜的力学性能也有帮助。当GO含量较大时，片层在PLA基体中分散不均匀，导致GO聚集，不利于提高膜拉伸强度。GO掺杂含量为0.5%时，膜的拉伸强度提升幅度较小。图3掺杂GO的PLA膜的TG曲线和拉伸强度Fig.3TG curves and tensile strength of PLA membrane doped with GO10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.06.010.F3a1（a）TG曲线10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.06.010.F3a2（b）拉伸强度2.4PLA/GO膜孔隙率分析孔隙率直接影响血液透析膜的透析效果。图4为掺杂不同GO含量的PLA/GO膜的孔隙率变化。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.06.010.F004图4不同GO含量的PLA/GO膜的孔隙率变化Fig.4Changes in porosity of PLA/GO membrane with different GO content从图4可以看出，GO含量的增加，膜孔隙率呈现先增后降的趋势。当GO的掺杂量为0.25%时，PLA/GO膜的孔隙率达到最大值84.5%，相比于PLA膜的孔隙率提高1.1倍。PLA/GO膜孔隙率的变化与相分离过程密切相关。当GO含量较少时，铸膜液中亲水性的GO加快瞬时相分离过程，有利于小孔形成，PLA/GO膜孔隙率增大。GO掺杂量过多时，铸膜液的黏度增大，导致相分离过程较慢不利于孔形成，造成PLA/GO膜孔隙率逐渐降低，掺杂GO含量为0.5%时，复合膜的孔隙率约为78.5%。2.5PLA/GO膜表面性能分析PLA基血液透析膜材料需要具有一定的亲水性，防止蛋白质或血小板在膜表面吸附和沉积。通过水接触角评价膜材料的亲水性，一般水接触角越小，材料的亲水性越高。图5为不同GO含量的PLA/GO膜水接触角和水通量变化。图5不同GO含量的PLA/GO膜水接触角和水通量变化Fig.5Water contact angle and water flux changes of PLA/GO membrane with different GO content10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.06.010.F5a1（a）接触角10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.06.010.F5a2（b）水通量从图5a可以看出，纯PLA膜的水接触角约为78.6°，而加入GO后，膜的水接触角明显下降，当GO掺杂量达到0.25%时，PLA/GO的接触角达到最小约为68.5°。因为具有大量的羟基、羧基基团的高亲水性的GO改变了PLA材料的亲水性。但是，随着GO的含量继续增加，PLA/GO膜的水接触角增大，亲水性变差。这是由于GO表面尽管有较多的亲水性基团，但是片层中央仍然表现疏水性，过量的GO在弱相互作用力的驱动下，在PLA膜表面出现团聚，导致膜表面粗糙度变大，亲水性变差。从图5b可以看出，纯PLA膜的水通量为96.7 L/(m2·h)。掺杂GO后，膜的水通量出现先增后降的趋势。相比于纯PLA膜，GO含量为0.25%，PLA/GO的水通量为最大值340.5 L/(m2·h)。但是随着GO含量继续增大，PLA/GO的水通量反而变小。这是由于当GO含量较少时，PLA/GO膜的表面的亲水性和孔隙率都增大，在相同的实验条件下，亲水性的膜容易聚集水分子，增大的孔隙率加速水的渗透。但随着GO的掺杂量继续增大，一方面GO的团聚导致膜亲水性变差不利于水分子的聚集，另一方面铸膜液黏度增大不利于实现相分离，膜孔隙率减小，PLA/GO复合膜的水通量变差。2.6PLA/GO膜生物相容性分析2.6.1细胞毒性分析生物医用材料要求具有良好的生物相容性。图6为不同GO含量的PLA/GO膜对L929和MC3T3-E1细胞活性影响。从图6a可以看出，纯PLA膜浸提24 h后与L929共培养24 h后，L929细胞存活率达到92.8%，表现良好的细胞存活率。相比之下，不同含量GO的PLA/GO复合膜使得L929细胞的存活率均在80%以上，表明GO的引入不会影响PLA材料的生物相容性，这与GO具有优异生物相容性和低细胞毒性有关[15]。从图6b可以看出，PLA膜和PLA/GO膜浸提液与MC3T3-E1细胞共培养24 h后，细胞存活率均高于80%，表明PLA/GO膜具有作为植入性可降解生物支架的潜力。图6不同GO含量的PLA/GO膜对L929和MC3T3-E1细胞活性影响Fig.6The effects of PLA/GO membrane with different GO content on the cell viability of L929 and MC3T3-E110.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.06.010.F6a1（a）L92910.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.06.010.F6a2（b）MC3T3-E12.6.2抗凝血性能分析由于直接测定血浆凝血因子的含量评价透析膜的血液相容性比较困难，通常测定APTT间接评价膜血液相容性。图7为不同GO含量的PLA/GO膜的APTT和PT变化。从图7a可以看出，纯PLA膜的APTT值约为50 s，掺杂不同含量GO的PLA/GO膜的APTT值出现先增大后减少的趋势，GO含量为0.25%时，APTT达到最大值88 s，表明此时PLA/GO膜材具有较好的血液相容性。当GO含量过高时，膜表面亲水性降低且粗糙度增大，导致血液中蛋白易于聚集在材料表面。相比于APTT用于测试材料的内源性凝血系统，PT用于测试材料的外源性凝血系统。PT值越长，表明凝血酶原转化为凝血酶的效率越低，材料的抗凝血效果越好。从图7b可以看出，PLA膜的PT值约为15 s，高于血浆的PT值。PLA/GO膜的PT值相比于纯PLA膜具有明显的提高，GO含量0.25%时，PT值约为23.5 s，提高1.56倍。尽管GO含量较高，PT值出现下降，但PLA/GO膜抗凝血效果依然高于纯PLA膜。图7不同GO含量的PLA/GO膜的APTT和PT值变化Fig.7Changes in APTT and PT values of PLA/GO membranes with different GO content10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.06.010.F7a1（a）APTT10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.06.010.F7a2（b）PT3结论（1）通过非溶剂诱导相分离技术制备聚乳酸/氧化石墨烯复合膜(PLA/GO)。结果表明：GO成功加入PLA基材。随着GO含量的增加，膜的孔隙率、亲水性和水通量呈现先增大后减小的趋势。GO可以提高PLA膜的热稳定性和拉伸性能。掺杂0.25% GO的PLA/GO膜具有较好的孔隙率和亲水性。（2）APTT和PT测试结果表明，掺杂生物相容性的GO可以提高PLA膜的血液相容性。GO的引入可以提高PLA材料的综合性能，对PLA膜在生物医用材料领域的应用具有参考意义。