辣椒碱（capsaicin）是辣椒中香草酰胺类生物活性成分，可以被用作食品添加剂、减肥药、降血脂及外用止痒剂[1-3]等。在畜牧业生产中，辣椒碱作为饲料添加剂，可以防止饲料霉变，提高饲料利用率和畜禽的生产性能，减缓应激反应，改善肉品质，增强机体的抗病力[4]。养禽生产中会发生长期慢性应激刺激，这会导致淋巴细胞不断激活，产生过多的促炎细胞因子，促炎细胞因子会抑制这些组织的合成代谢，促进分解代谢；另一方面会作用神经-内分泌系统，增加肾上腺糖皮质激素分泌，降低生长激素和胰岛素样生长因子-1分泌，两者均会抑制机体生长发育[5]。长期慢性应激刺激对养禽业造成极大威胁且目前缺乏有效的调控手段。目前，辣椒碱抗炎作用在饲料添加剂中的应用鲜有报道。顾云锋等[6]在40周龄海兰褐蛋鸡日粮中分别添加50、100、150和200 mg/kg辣椒碱，结果表明，辣椒碱可以提高蛋鸡日采食量、蛋黄颜色、蛋壳厚度、蛋黄和血清总超氧化物歧化酶活性，降低蛋黄脂肪、胆固醇含量以及蛋黄和血清丙二醛含量。范秋丽等[7]研究辣椒碱对817肉鸡生长性能和血清生化指标的影响，单剂量组肉鸡2~41日龄在基础饲粮中添加75 mg/kg辣椒碱，混合剂量组肉鸡2~21日龄的基础饲粮中，辣椒碱、姜辣素和大蒜素添加量为37、50和200 mg/kg，22~42日龄辣椒碱、姜辣素和大蒜素添加量为75、100和400 mg/kg。该研究表明，试验组料重比和血清中丙二醛含量均降低，免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白A（IgA）含量提高。Bravo等[8]在1日龄罗斯308公鸡日粮中添加2%辣椒素植物提取物，发现能量的利用和生长性能均有提高。本试验研究辣椒碱的体外抗炎活性，为辣椒碱抗炎相关分子机制及其在动物生产中实际应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物150只8周龄、（20±2）g、SPF级Balb/c小鼠由锦州医科大学生命科学学院提供。1.1.2主要试剂辣椒碱购自上海源叶生物科技有限公司；脂多糖（LPS）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-10（IL-10）试剂盒、CCK-8试剂盒、超敏ECL化学发光检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；Trizol、Gelstain 10000X、四甲基偶氮唑盐（MTT）标准品购自北京全式金生物技术有限公司；二甲基亚砜（DMSO）、1 000 bp DNA ladder marker购自美仑生物技术（大连）有限公司；RPMI-1640培养基、Taq PCR Master Mix、Dnase/Rnase-free Deion、逆转录试剂盒TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0、β-actin抗体购自北京天根生物科技有限公司。1.2试验方法1.2.1巨噬细胞分离培养巨噬细胞分离培养参考文献[9-10]的试验方法。取150只小鼠制备及培养小鼠腹腔巨噬细胞，进行分离、提取及纯化，将完全培养基置于5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养，待用。1.2.2巨噬细胞增殖活力的检测应用CCK-8法检测巨噬细胞的增殖活力，筛选有效且安全的辣椒碱质量浓度[11]。取分离的巨噬细胞将浓度调整为4×104个/L，采用96孔板，分6组，每组3个重复，每孔加100 μL细胞，5% CO2、37 ℃恒温培养4 h，进行贴壁，弃掉孔内培养基，添加100 μL含终质量浓度0、15、30、60、120和240 mg/L辣椒碱的完全培养基，培养24 h，弃培养基，加入含有质量分数10% CCK-8溶液的完全培养基，培养2 h，检测450 nm波长处OD值。细胞增殖活力=辣椒碱组OD450 nm/对照组OD450 nm×100%(1)1.2.3巨噬细胞吞噬能力的检测参考李莉等[12]中性红吞噬试验法。取分离的巨噬细胞，将浓度调整为2×109个/L，采用96孔板，设KB组、MX组、YL30组、YL60组、YL120组和YL240组，每组3个重复，每孔加100 μL细胞，置于37 ℃、5% CO2培养箱4 h，洗去未贴壁的细胞。KB组为对照组（加入含终质量分数0.1% DMSO的完全培养基），MX组为LPS应激模型组（加入1 mg/L LPS），YL30组、YL60组、YL120组和YL240组为给药组（加入30、60、120、240 mg/L辣椒碱），培养24 h，每孔加入0.1％中性红溶液100 μL，培养2 h，弃上清，利用PBS洗涤3次，每孔加入100 μL细胞溶解液，置4 ℃冰箱过夜，待细胞溶解后测定570 nm处OD值。吞噬率=辣椒碱组OD450 nm/空白组OD450 nm×100%(2)1.2.4IL-1β、IL-10含量的检测IL-1β、IL-10含量的检测采用ELISA法，参考王潇娅等[13]试验。调整巨噬细胞浓度为5×106个/L，采用24孔培养板，设KB组、MX组、YD组、YL30组、YL60组、YL120组和YL240组，每组3个重复，每孔加100 μL细胞，置于37 ℃、5% CO2培养箱4 h，洗去未贴壁的细胞。KB组（加入含终质量分数0.1% DMSO的完全培养基），MX组（加入1 mg/L LPS），YD组为地塞米松组（加入10 mg/L地塞米松），YL30组、YL60组、YL120组和YL240组（加入30、60、120、240 mg/L辣椒碱），培养1 h，分别加入LPS（终质量浓度为1 mg/L），培养24 h，12 000 r/min离心15 min，收集上清液，依据ELISA试剂盒说明书检测IL-1β、IL-10含量。1.2.5IL-1β、IL-10、My D88、NF-κB mRNA表达水平的检测IL-1β、IL-10、My D88、NF-κB mRNA表达水平的检测采用反转录实时荧光定量PCR法，参考王翠芳等[14]试验。调整巨噬细胞浓度为5×106个/L，在24孔培养板中每孔接种100 μL细胞，分组同IL-1β、IL-10含量的检测，与辣椒碱培养细胞1 h，加入LPS共同培养细胞4 h，收集细胞。使用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞，加入1 mL/孔Trizol，静置5 min，转移至1.5 mL离心管。每管加入200 μL三氯甲烷，充分混匀，12 000 r/min离心10 min分层，利用无RNA酶枪头吸取上层液体转移至无RNA酶离心管内，加入等体积异丙醇，12 000 r/min离心10 min得白色沉淀，使用75%冰乙醇清洗2遍，室温静置使沉淀干燥，加无RNA酶水复溶，定量，加水补齐至mRNA浓度一致，按照逆转录试剂盒说明将mRNA逆转录成cDNA，通过特异性引物对细胞中IL-1β、IL-10、My D88、NF-κB及内参基因β-actin进行扩增。反应中依照试剂盒说明采用20 μL试验体系，其中上下游引物各0.5 μL、Mix 10 μL、逆转录反应产物1 μL、无RNA酶H2O 8 μL。进行Real-time PCR反应，其扩增程序设置为预变性94 ℃、1 min，变性94 ℃、30 s，退火58 ℃、30s，延伸72 ℃、1 min，延伸72 ℃、10 min，共36个循环，采用2－ΔΔCt方法进行数据分析，计算待测基因的相对表达量。基因引物序列见表1[15-16]。ΔΔCt=(Ct目的基因－Ctβ-actin)试验组－(Ct目的基因－Ctβ-actin)空白组 (3)10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.017.T001表1基因引物序列引物名称引物序列（5'-3'）产物长度/bpβ-actinF：CAGCTGAGAGGGAAATCGTG104R：CTCCAGGGAGGAAGAGGATGIL-1βF：TTCATCTTTGAAGAAGAGCCCAT102R：TCGGAGCCTGTAGTGCAGTTIL-10F：CCTTAATGCAGGACTTTAAGGGTTA134R：ACCCAGGGAATTCAAATGCTMy D88F：TGTCTCCAGGTGTCCAACAG119R：CTTGGTGCAAGGGTTGGTATNF-κBF：GAGGCGTGTATTAGGGGCTA158R：ACGCTCAGGTCCATCTCCTT1.3数据统计与分析采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1辣椒碱体外对巨噬细胞增殖活力的影响（见表2）由表2可知，15、30、60、120和240 mg/L辣椒碱组巨噬细胞增殖活力与对照组差异均不显著（P0.05），表明辣椒碱在试验浓度范围内无细胞毒性作用，选用30、60、120和240 mg/L进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.017.T002表2辣椒碱体外对巨噬细胞增殖活力的影响辣椒碱浓度/(mg/L)增殖活力/%0103.14±5.2515112.19±6.9030113.04±10.4560109.11±7.94120108.29±3.29240107.05±4.36注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2辣椒碱体外对巨噬细胞吞噬功能的影响（见表3）由表3可知，MX组、YL60组、YL120组和YL240组巨噬细胞吞噬率均极显著高于KB组（P0.01）；YL60组、YL120组和YL240组巨噬细胞吞噬功能均极显著高于MX组（P0.01）；YL120组巨噬细胞吞噬功能极显著高于YL30组、YL60组和YL240组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.017.T003表3辣椒碱体外对巨噬细胞吞噬功能的影响组别吞噬率KB组100.00±0.00EMX组147.44±6.18DYL30组155.31±8.13CDYL60组191.71±7.98BYL120组224.62±3.24AYL240组165.97±4.28C%结果表明，辣椒碱能够增强巨噬细胞的吞噬功能，巨噬细胞吞噬功能与椒碱浓度呈良好的剂量-效应关系。辣椒碱浓度升高至240 mg/L时，巨噬细胞的吞噬功能下降，YL120组抗炎效果最佳。2.3辣椒碱体外对IL-1β含量及mRNA表达的影响（见表4）由表4可知，MX组IL-1β含量极显著高于其他各组（P0.01）；YL120组IL-1β含量极显著低于YD组（P0.01）；YL120组IL-1β含量极显著低于YL30组和YL240组（P0.01），显著低于YL60组（P0.05）。MX组IL-1β mRNA相对表达量极显著高于其他各组（P0.01）；YL120组IL-1β mRNA相对表达量显著低于YD组（P0.05），YL60组IL-1β mRNA相对表达量低于YD组，但差异不显著（P0.05）；YL120组IL-1β mRNA相对表达量极显著低于YL30组（P0.01），显著低于YL60组和YL240组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.017.T004表4辣椒碱体外对IL-1β含量及mRNA表达的影响组别IL-1β/(ng/L)IL-1β mRNA相对表达量KB组37.36±2.01Dd1.86±0.49DeMX组89.18±3.06Aa745.06±36.32AaYD组54.39±5.77Cc635.19±72.92BCbcYL30组70.45±5.93Bb718.39±34.39BbYL60组48.43±5.11CDc593.18±44.01CcYL120组39.91±1.12Dd513.12±55.78CdYL240组63.39±6.76BCb673.28±33.01BCb结果表明，辣椒碱可以通过抑制促炎因子IL-1β mRNA表达来抑制IL-1β分泌，从而发挥抗炎作用。其抗炎活性与辣椒碱浓度呈良好的剂量-效应关系，辣椒碱浓度升高至240 mg/L时，其抗炎活性能下降，YL120组抗炎效果最佳。2.4辣椒碱体外对IL-10含量及mRNA表达的影响（见表5）由表5可知，MX组IL-10含量极显著高于KB组（P0.01）；YD组、YL30组、YL60组、YL120组和YL240组IL-10含量均极显著高于MX组（P0.01）；YL120组IL-10含量显著高于YD组（P0.05）；YL60组IL-10含量高于YD组，但差异不显著（P0.05）；YL120组IL-10含量极显著高于YL30组和YL240组（P0.01），高于YL60组，但差异不显著（P0.05）。MX组IL-10 mRNA相对表达量极显著高于KB组（P0.01）；YD组、YL60组和YL120组IL-10 mRNA相对表达量均极显著高于MX组（P0.01）；YL30组和YL240组IL-10 mRNA相对表达量显著高于MX组（P0.05）；YL120组和YL60组IL-10 mRNA相对表达量极显著高于YD组、YL30组和YL240组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.017.T005表5辣椒碱体外对IL-10含量及mRNA表达的影响组别IL-10/(ng/L)IL-10 mRNA相对表达量KB组19.44±5.85Dd1.50±0.60DeMX组868.89±46.71Cc38.66±5.64CdYD组1 937.22±362.99ABb93.81±9.83BbYL30组1 720.56±267.88Bb58.61±8.01CcYL60组2 226.11±209.72ABab122.46±15.24AaYL120组2 420.56±145.61Aa132.43±17.63AaYL240组1 831.67±220.48Bb62.65±8.58Cc结果表明，辣椒碱可以通过促进抗炎因子IL-10 mRNA的表达来促进IL-10分泌，从而发挥抗炎作用。辣椒碱抗炎活性与辣椒碱浓度呈良好的剂量-效应关系，辣椒碱浓度升高至240 mg/L时，其抗炎活性能下降，YL120组抗炎效果最佳。2.5辣椒碱体外对My D88和NF-κB mRNA表达的影响（见表6）由表6可知，MX组My D88 和NF-κB mRNA相对表达量极显著高于其他各组（P0.01）；YD组、YL30组、YL60组、YL120组和YL240组My D88和NF-κB mRNA相对表达量差异均不显著（P0.05）。结果表明，辣椒碱的抗炎活性可能与NF-κB信号通路有关。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.017.T006表6辣椒碱体外对My D88和NF-κB mRNA表达的影响组别My D88 mRNA相对表达量NF-κB mRNA相对表达量KB组0.95±0.17Cc1.53±0.55CcMX组2.45±0.33Aa5.15±0.27AaYD组1.47±0.24BCb3.51±0.48BbYL30组1.54±0.07Bb3.62±0.29BbYL60组1.41±0.11BCb3.54±0.72BbYL120组1.39±0.28BCb3.16±0.23BbYL240组1.52±0.27Bb3.89±0.43Bb3讨论IL-1β是重要的致炎因子，可以诱导单核细胞和多核细胞趋化至炎症区域并释放溶酶体酶，能够促进中性粒细胞从骨髓进入血液。在炎症反应方面，IL-10能够通过下调单核细胞表面主要组织相容性抗原Ⅱ的表达，降低抗原呈递作用、抑制炎性细胞的激活、迁移和黏附；同时，可以抑制炎症因子的合成与释放，从而起到抗炎的作用。张彩云[5]对蛋鸡雏进行频繁免疫应激刺激，发现淫羊藿苷可以有效抑制白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）分泌及mRNA的表达。童小峰等[17]选用56周龄罗曼粉蛋鸡，在基础日粮中添加0.5 g/kg和2 g/kg淫羊藿苷，试验13 w，检测输卵管组织中炎性细胞因子mRNA表达量，发现0.5 g/kg淫羊藿苷组和2 g/kg淫羊藿苷组干扰素（IFN）-γ、IL-6和IL-4 mRNA表达均降低，0.5 g/kg淫羊藿苷组IL-10 mRNA表达降低，2 g/kg淫羊藿苷组TNF-α mRNA的表达降低。本研究结果表明，辣椒碱可以通过抑制和促进IL-1β和IL-10 mRNA表达，来抑制IL-1β和IL-10分泌，从而达到抗炎的作用，与上述研究结果基本一致。TLR/My D88/NF-κB信号通路对疾病的发生与调控进行广泛的参与，并能引起机体产生炎症免疫反应，激活My D88依赖性[18]。某些中药活性成分对NF-κB活性有影响，已被用于治疗和预防许多炎症性疾病[19]。罗煜等[20]观察黄连异喹啉生物碱盐酸巴马汀在人急性单核白血病细中的抗炎活性，结果显示，盐酸巴马汀的抗炎作用机制与NF-κB/p38 MAPK信号通路和NLRP3炎症小体信号通路相关。结果表明，30~240 mg/L辣椒碱可以显著降低由LPS诱导的My D88和NF-κB mRNA的表达，提示辣椒碱的抗炎活性可能与NF-κB信号通路有关，具体作用机制有待进一步研究。4结论辣椒碱对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞具有抗炎作用，其抗炎活性可能是通过抑制促炎细胞因子IL-1β的分泌并提高抗炎细胞因子IL-10的分泌实现的，其作用机制可能与NF-κB信号通路有关。