许多微生物可以产生两亲性分子的生物表面活性剂，如糖脂、脂肽和中性脂质、磷脂等[1-3]。脂肽是天然合成的环状化合物，由疏水性烷基链和亲水性多肽组成[4-5]。脂肽的两亲特性可以诱导脂质双分子层形成孔型通道，分解病原体，有较强的病原体抗性。生物表面活性剂除具有抗菌和抗病毒等特性以外，还具有增强采油、生物修复和排污去油等功能[6-7]。此外，脂肽生物表面活性剂具有高生物降解性，对环境友好，在极端温度和pH值条件下有较高稳定性。脂肽生物表面活性剂可以提高畜、禽等增重率及营养指标[8-9]。芽孢杆菌生产的脂肽主要分3大类：表面活性素、芬枯草菌素和伊枯草菌素[10-11]。表面活性素作为脂肽的典型代表，由7个氨基酸和一个长度为C13-C15的羟基脂肪酸以内酯键结合形成环状的化合物[12-13]。芬枯草素的肽链由10个氨基酸组成，包含一个鸟氨酸，且第3位的酪氨酸与第10位的异亮氨酸形成内酯键，形成环状结构[14-15]。伊枯菌素与表面活性素结构较为类似，都包含一个由7个氨基酸组成的肽环，但脂肪酸链为一个长度为C14-C17的氨基脂肪酸链[16]。在本研究从贝莱斯芽孢杆菌Ndl5中分离和纯化脂肽生物表面活性剂，并对其结构进行鉴定，为贝莱斯芽孢杆菌发酵产物分离纯化提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1供试菌株贝莱斯芽孢杆菌Ndl5由大连工业大学生物工程学院国家与地方联合实验室提供。1.1.2培养基种子培养基（LB培养基）：胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、酵母浸粉5 g、去离子水1 L，调节pH值为7.5。发酵培养基（LB培养基）：胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、酵母浸粉5 g、去离子水1 L，调节pH值为7.5。1.2试验方法1.2.1种子液及发酵液的制备取一环经过LB固体培养基活化的菌株于LB种子培养基中，30 ℃、200 r/min摇床培养24 h，得到一级种子液。按接种量2%于LB种子培养基中，30 ℃、200 r/min摇床培养24 h，得到二级种子液。按接种量2%于LB发酵培养基中，30 ℃、200 r/min摇床培养36 h，得到贝莱斯芽孢杆菌Ndl5发酵液。1.2.2脂肽粗粗提取物的制备发酵培养结束后，发酵液在20 ℃、5 000 r/min离心10 min，除去菌体。上清液使用6 mol/L盐酸将pH值调至2.0，于4 ℃冰箱放置12 h，4 ℃、10 000 r/min离心20 min，收集沉淀。沉淀使用甲醇反复提取，甲醇提取液旋转蒸干后得固体脂肽粗提取物。1.2.3固相萃取（SPE）纯化固体脂肽粗提取物使用0.1%甲酸甲醇：0.1%甲酸水=50∶50溶液溶解，选用UniElut C18 HC（1 g/6 mL）固相萃取柱。使用0.1%甲酸甲醇：0.1%甲酸水=50∶50溶液活化固相萃取柱，每次1 mL，活化5次。使用0.1%甲酸甲醇：0.1%甲酸水=50∶50溶液平衡固相萃取柱，每次1 mL，平衡5次，上样1 mL。第1次使用0.1%甲酸甲醇：0.1%甲酸水=50∶50溶液淋洗固相萃取柱并收集淋洗液，每次1 mL，淋洗5次，淋洗样品记为S1；第2次使用0.1%甲酸甲醇：0.1%甲酸水=80∶20溶液淋洗固相萃取柱并收集淋洗液，每次1 mL，洗脱5次，淋洗样品记为S2；第3次使用0.1%甲酸乙腈淋洗SPE并收集淋洗液每次1 mL，洗脱5次，淋洗样品记为S3。S1、S2和S3分别接出并旋蒸干燥备用。1.2.4反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析与制备固相萃取纯化后得到的S1、S2和S3样品在1260 Infinity配备二极管阵列检测器液相色谱仪（美国安捷伦公司）上分析，确定色谱条件后在半制备柱上进行半制备。分析柱采用Acchrom C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL。半制备柱采用Acchrom C18（10 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，流速为3.3 mL/min，进样量为500 μL。流动相A为含0.1％甲酸乙腈，B为含0.1％的甲酸超纯水，初始分析色谱条件为0~30 min、10%~95%乙腈（0.1%甲酸）；30~40 min，95%乙腈（0.1%甲酸）。优化后分析及半制备色谱条件为0~50 min、75%乙腈（0.1%甲酸）。液相半制备后鉴定馏分的色谱条件为：流动相A为乙腈（含有0.1%甲酸），流动相B为水（含有0.1%甲酸），0~35min保持80%A等度洗脱。上述检测波长均为280 nm，柱温为30 ℃，样品均用0.22 µm微孔滤膜过滤。1.2.5纯化样品电喷雾质谱分析质谱分析在安捷伦6545系列配有电喷雾（ESI）Q-TOF-MS上进行。采用Acchrom C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）色谱柱，流速为0.2 mL/min。质谱条件为正离子模式扫描，气体温度320 ℃、干燥气流速8 L/min、喷雾气压35 psi、鞘气温度350 ℃、鞘流气速11 L/min、毛细管电压3 500 V、一级质谱质量扫描范围100~3 000 m/z。2结果与分析2.1固相萃取分离纯化样品（见图1）固相萃取分别纯化的样品经过反相色谱初始分析，结果表明固相萃取可以对样品起到很好的划段分离。由图1可知，对脂肽粗提物初步分离时，固相萃取起到良好的分离效果，可以减少复杂样品对色谱柱的损害。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.015.F001图1固相萃取纯化的样品与发酵液甲醇粗提物HPLC对比2.2反相色谱纯化样品（见图2）固相萃取纯化所得到的样品S3在反相色谱上经过75%乙腈（添加0.1%甲酸）等度洗脱。由图2可知，将色谱峰1（记为S3-L1）、色谱峰2（记为S3-L2）和色谱峰3（记为S3-L3）分别收集后，冷冻干燥后备用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.015.F002图2样品S3反相HPLC条件优化2.3色谱收集馏分的再鉴定（见图3）如图3所示，反相色谱收集的S3-L1、S3-L2和S3-L3经80%乙腈（添加0.1%甲酸）等度洗脱，S3-L1和S3-L3为单个色谱峰，结果表明75%乙腈（添加0.1%甲酸）等度洗脱可以将S3-L1和S3-L3完美分离，以此条件进行后续半制备和质谱分析鉴定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.015.F003图3反相HPLC收集馏分的色谱鉴定2.4质谱鉴定（见图4~图7）由图4可知，S3-L1质荷比（m/z）为1 022.676 3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.015.F004图4S3-L1一级质谱鉴定由图5可知，b离子片段顺序为909.590 2（b7）、796.508 0（b6）、582.411 3（b4）、469.327 1（b3）和356（b2）。y离子依次为667.444 7（y6）、554.355 5（y5）、441.270 9（y4）和227.175 4（y2），推测S3-L1为C14-Surfactin，一级结构为C14-Glu1-Leu2-Leu3-Val4-Asp5-Leu6-Leu7。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.015.F005图5S3-L1二级质谱鉴定由图6可知，S3-L3质荷比（m/z）为1 036.691 9。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.015.F006图6S3-L3一级质谱鉴定由图7可知，推测S3-L3为C15-Surfactin，一级结构为C15-Glu1-Leu2-Leu3-Val4-Asp5-Leu6-Leu7。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.015.F007图7S3-L3一级质谱鉴定3结论通过反相半制备从贝莱斯芽孢杆菌Ndl5中分离出C14和C15两种Surfactin同系物，C14-Surfactin的结构为C14-Glu1-Leu2-Leu3-Val4-Asp5-Leu6-Leu7，C15-Surfactin的结构为C15-Glu1-Leu2-Leu3-Val4-Asp5-Leu6-Leu7。固相萃取能够简单高效地对贝莱斯芽孢杆菌发酵液进行预处理，且固相萃取技术在发酵液预处理过程中可以去除大量干扰杂质，这一过程有助于后续脂肽生物表面活性剂的分离和制备。传统脂肽生物表面活性剂预处理方法将甲醇粗提物过薄层层析或者凝胶柱等步骤，操作烦琐、费时，本研究尝试采用固相萃取技术处理脂肽甲醇粗提物，实现了样品快速划段分离，减少了直接上样（发酵液）对色谱柱的损害，快速实现样品的预处理，简化试验操作流程，并且探索出新的色谱分离条件，实现脂肽表面活性剂Surfactin的分离，且方法简便、快速，且分离效果较好。