核糖核酸（RNA）简称核酸，是生物体内重要的高分子化合物，对维持机体的正常功能具有重要作用，是特定生理条件下不可缺少的营养成分[1]。核酸酵母工业逐步成为我国食品及发酵工程领域的支柱产业之一。酵母细胞RNA含量较高，因此工业生产中采用酵母发酵法生产RNA[2]。在不同酵母菌株中，假丝酵母的RNA含量最高，一般在8%以上[3]。但假丝酵母菌对人体有致病性[4]。近年来，出于对食品安全的考虑，研究集中在开发能够产生大量RNA的芽殖酵母（S. cerevisiae）菌株上[5-7]。文章综述酿酒酵母细胞RNA生物合成的分子机制及其提高RNA含量的最新研究进展，为酿酒酵母核酸合成机制的研究以及构建工业高核酸酿酒酵母菌株提供参考。1酵母细胞RNA的生物合成酿酒酵母细胞内RNA包括mRNA、rRNA、tRNA和非编码RNA。其中rRNA是食品工业中的重要组成部分，是RNA主要来源，约占酿酒酵母RNA总含量的80%[6]，mRNA和tRNA各占15%和5%[8]。rRNA是生产核糖体最主要的原料，核糖体是细胞内最大、最复杂的RNA蛋白复合物之一，含有多种蛋白质。核糖体主要由4个核酸组成，包括18S rRNA、25S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA和79种核糖体蛋白（RPs），其中64种是细胞生长所必需的[8]。因此，rRNA和核糖体是提高酿酒酵母RNA含量的重要指标。1.1rRNA的合成（见图1、图2）由图1可知，酵母中约有150~200个rRNA基因以串联重复的方式排列[9]。rDNA基因簇由两类聚合酶转录，分别为由RNA聚合酶Ⅰ转录形成35S rRNA以及由RNA聚合酶Ⅲ转录形成5S rRNA。其中35S rRNA被加工成18S、5.8S和25S rRNA[10]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.036.F001图1酵母胞内rDNA结构由图2可知，35S pre-rRNA形成后，经过甲基化和嘧啶化以及核酸外切酶和内切酶的作用下，在A0位点切掉5' ETS以及在Al位点切割形成32S rRNA，其中Al位于18S rRNA的5'末端，随后在A2位点切割形成20S rRNA和27SA2 rRNA。细胞质中20S pre-rRNA 在D位点切割形成成熟18S rRNA。随后在核仁中对27S rRNA进行进一步加工处理，其中27S rRNA的剪切成熟过程包含两条不同的途径，约85%的27SA2 rRNA在A3位点切割形成27SA3 rRNA然后被立刻加工处理形成27SBs rRNA。剩下约15%的27SA2 rRNA直接在B1L位点切割形成27SBL rRNA。最后，两种不同形式的27SB rRNA在C2-C1位点切割形成25S rRNA和5.8S rRNA。此外，5S rRNA在核仁中由RNA聚合酶Ⅲ单独转录后逐步装配到60S核糖体亚基前体上[11]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.036.F002图2酵母中 rRNA的转录和剪切成熟过程1.2核糖体的合成核糖体是由60S大亚基和40S小亚基组成的复杂复合物，其中40S小亚基由18S rRNA和33个核糖体蛋白组成，60S大亚基包含25S、5.8S和5S rRNA以及46个核糖体蛋白。功能性核糖体的形成是高度复杂的过程，需要大量分子反应的相互作用。真核细胞中核糖体的形成涉及3种不同的RNA聚合酶的参与，会产生4种rRNA和约80种核糖体蛋白质。几乎所有核糖体蛋白质都存在1个拷贝中的核糖体，不同核糖体成分产生在不同阶段，组装核糖体发生在不同细胞室中，正常生长细胞不含有大多数的游离核小体成分。因此，各种核糖体基因表达必须受到严格的协调控制，以确保不同rRNA和核糖体蛋白质组分等摩尔量产生。此外，细胞可以根据环境条件变化，如营养条件或温度变化等，协调地调节整套核糖体基因的表达，从而改变对蛋白质生物合成能力需求。研究发现，在核糖体的合成过程中约有200多个组装因子参与[12-14]。这些因子主要涉及核糖体组装合成过程中需要的各种酶，还包括未知特征结构蛋白。U3、U14、snR30也参与35S pre-rRNA加工，它们均属于snoRNA[15]。几十个核糖体蛋白和成熟RNA通过各种烦琐而精细高效的剪切和组装等过程，最终形成细胞内最重要的细胞器核糖体[16-17]。处于指数期的酿酒酵母细胞，每分钟需要合成多达2 000个核糖体[8]。虽然在酵母基因的结构和功能方面已经收集大量信息，但对控制这些基因表达的调控机制还不完全了解。对于环境信号的传导和这些信号最终受体几乎一无所知。rRNA基因的转录调控可能是核糖体生物合成复杂过程的核心。核糖体的合成主要分为4个步骤：90S核糖体前体复合物的合成，组装成分包括rRNA、核糖体蛋白、组装因子以及sonRNA；40S和60S核糖体前体复合物的一系列的剪切，加工和修饰以及蛋白质的组装；40S小亚基和60S大亚基的出核转运；质量控制与监控[8,10-11,18]。2提高酵母细胞RNA含量相关基因的研究进展2.1IMP4蛋白家族基因成熟的真核生物含有5S、18S、25S和5.8S rRNA共4种核糖体RNA。其中，5S rRNA是由聚合酶Ⅲ转录，而18S、25S和5.8S rRNA是由聚合酶Ⅰ转录形成一条35S pre-rRNA，经过一系列的修饰和剪切形成成熟的18S、25S和5.8S rRNA。Venema等[19]发现，在核糖体组装之前和组装同时，35S pre-rRNA经过大量剪切、处理和加工。在整个成熟过程中大约有200个非核糖体蛋白组装因子发挥重要作用。例如部分组装因子可以作为RNA解旋酶，打开pre-rRNA的二级结构，使剪切顺利进行[15,20-21]。部分组装因子相互之间形成复合物，参与核糖体前体成型，使核糖体前体处于正确、稳定的构象，为下一步剪切或者修饰过程奠定基础[22-23]。IMP4家族蛋白（IMP4、RPF1/2、SSF1/2、BRX1）是一类重要的组装因子，它们均有1个17个氨基酸长度的识别区域，用于结合rRNA。其中IMP4p作为U3加工体的一个重要蛋白，参与细胞核内pre-18S rRNA（A0、A1和A2位点）的加工[10]。RPF1p能与35S、27SA和27SB pre-rRNA结合，作为66S核糖体前体组装因子，参与66S核糖体前体的核内组装[24]。RPF2p能与5S rRNA、7S和27SB pre-rRNA结合，在核糖体大亚基的形成过程中和内转录间隔区域2的加工过程中发挥重要作用。BRX1p参与整个大核糖体亚基的成熟过程，与RPF1p/2p蛋白拥有相似功能，一是作为组装因子，参与66S核糖体前体的核内组装[25]；二是在内转录间隔区域2的加工过程中发挥重要作用[26]。SSF1p/SSF2p是处理27S pre-rRNA所必需的蛋白，在促进细胞交配能力，调节细胞生长中起基础性作用[27-28]。2.2FHL1和IFH1基因酿酒酵母中存在79个核糖体蛋白，它们由138个基因转录，约50%RNA转录酶Ⅱ用于核糖体蛋白转录[29]。2004年，Jorgensen等[30]、Schawalder等[31]在核糖体蛋白基因启动子上发现区别于RAP1p因子的两个转录因子FHL1p与IFH1p。研究表明，FHL1p天然结合到核糖体蛋白基因启动子上，IFH1p通过FHL1p的FHA区域与FHL1p结合，只有与IFH1p结合后才能刺激核糖体蛋白基本转录，所以FHL1p与IFH1p结合是转录起始复合物结合到核糖体蛋白基因的关键因子[32-34]。因此，细胞内结合于核糖体蛋白基因启动子上IFH1p水平决定细胞内核糖体蛋白基因的转录水平[35]。其次，细胞遭受外界压力（营养匮乏、加热等）时，结合于启动子上的IFH1p因子急剧减少，结合于启动子上转录因子FHL1p基本保持不变[36-37]。这表明转录因子IFH1p与启动子结合是通过FHL1p实现的，说明转录因子IFH1p与启动子结合是核糖体蛋白转录的关键调节步骤。Rudra等[38]发现，FHL1和IFH1双敲除菌株的生长速率极慢，胞内RNA含量降低80%，核糖体合成速率降低90%~95%，说明FHL1与IFH1在酵母细胞核糖体合成过程中起重要作用。3选育高核酸酿酒酵母工作的研究进展通过发酵原料和发酵工艺的优化来间接提高酿酒酵母核酸含量是最常用研究方法，菌株的不同造成发酵原料和发酵工艺不同，需要消耗大量的时间与精力来探究菌株的发酵条件。因此，选育高核酸酿酒酵母菌株是目前提高酿酒酵母核酸含量最有效的途径。目前，诱变育种和基因工程是获取理想菌株最主要的研究方法。3.1诱变选育高核酸酿酒酵母目前，国内主要通过诱变筛选的方式选育高核酸酵母。唐文静等[39]筛选得到1株高产核糖核酸（RNA）的热带假丝酵母，通过优化核酸生产的生长条件，摇瓶中核酸产量从8%增加到16%，并通过优化发酵罐参数使菌体湿重达到80 g/L。袁仲等[40]提取的高核酸酵母通过啤酒酵母的酵素水解制备，优化工艺条件后，酵母提取物的I+G含量从3%~4%增加到10%~12%。倪晓丰等[41]利用硫酸二乙酯处理菌株选育到1株高核酸酿酒酵母BY23-195，在优化好的糖蜜培养基上，胞内RNA含量可以达到16.01%，具备很好的产业开发前景。采用物理诱变和化学诱变对菌株进行改造操作方便，突变率得到大幅度提高，但是诱变方向难以掌控，随机性大，后期的筛选工作难度增大[42]。经过诱变后的菌株生长性能和遗传稳定性都相对较差，该方法在实际应用中还需要改善。3.2基因工程选育高核酸酿酒酵母可以利用分子生物学手段选育高核酸酿酒酵母的方法，如敲除酵母胞内与rRNA转录相关的基因，通过诱变筛选出生长性能回复突变的菌株，在突变株中过表达敲除的基因，提高突变株的生长速率及核酸含量。Chuwattanakul等[43]通过回复突变的方式筛选得到rRNA含量提高的酿酒酵母菌株，通过比较分析，发现突变菌株核糖体40S小亚基合成相关的核糖体蛋白NOP15p基因序列的279位核苷酸T变成C。在野生型酵母菌株中过量表达核糖体蛋白基因NOP15能够显著提高酵母胞内rRNA含量（1.4倍），如果将NOP15基因序列279位的T变成C，过量表达NOP15T-279C，能够将酿酒酵母胞内rRNA含量提高2倍。RNA含量提高原因可能是NOP15过量表达导致某些功能积累RNA，但具体机制还不清楚。Khatun等[44]研究发现，在之前的突变株内提高核糖体蛋白基因RPL40A和RPL40B的转录水平能够提高RNA含量。可能是因为Rpl40p在27SB的成熟过程中发挥作用[45]。Khatun等[6]发现，在之前的突变株内提高rDNA拷贝数能够提高突变株RNA含量。另外，Guo等[46]研究发现，敲除HRP1基因同时表达FHL1、IFH1和SSF2基因将出发菌株核糖核酸含量提高38.8%，其中敲除HRP1基因可以提高菌株生长性能。这4种基因之间可能起到协同作用从而提高菌株RNA含量。4展望核酸酵母用途广泛，原料来源广，除甘蔗糖蜜，甜菜糖蜜和淀粉以外，还有木材水解液、亚硫酸废液、酒精废液、味精废液、淀粉加工废料等。能够生产酵母的原料均可以生产高核酸酵母。目前，核苷酸产品在哺乳母猪和仔猪饲料中作为调节剂，需求量非常大。不同酵母水解物中核苷酸含量及组成不同。有些国内产品虽然总核苷酸含量超过2%，但主要是呈核苷酸GMP与IMP，而不是酵母自身的核苷酸。国外进口产品虽然含有4种核苷酸，但AMP较少。所以，生产优质酵母类核苷酸产品具有很大的市场前景。目前，高核苷酸酵母遗传机制还不清晰，所以采用诱变育种和分子生物学技术相结合的育种方式，并通过组学手段来探究酿酒酵母核糖核酸遗传机制具有现实意义，可以为工业规模化生产优质酵母核苷酸产品提供参考。