当归（Angelica sinensis（Oliv.）Diels）为伞形科二年生草本植物，具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效[1]。受当归价格上涨等因素影响，当归种植规模在迅速扩张。《中国药典》规定当归的药用部位为根[2]。当归道地主产区会将当归地上部分拌入牲畜饲料。当归地上部分中含有挥发油、黄酮类等活性部分[3-5]。对当归地上部分提取物的抗氧化活性研究较少。黄酮类化合物属多酚类化合物，能够促进动物生长发育，增强动物免疫功能，减轻炎症反应和提高牲畜抗应激能力[6-8]。植物源黄酮类化合物具低毒的特点，可以作为饲料添加剂和兽药使用。本研究将双酶法和超声法联用，通过Box-Behnken响应面法优化当归地上部分总黄酮的提取工艺，并测定其抗氧化活性，旨在为当归资源的充分合理利用及活性研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验用当归地上部分，于2020年9月中下旬当归采挖之前采自甘肃省岷县禾驼乡，经甘肃农业大学陈垣教授鉴定为伞形科植物当归（Angelica sinensis （Oliv.） Diels）的地上部分。将样品茎、叶分离，45 ℃烘干，备用。1.2试验设备与试剂UV-1801紫外可见分光光度计（北京瑞丽分析仪器有限公司）、SB5200DTD超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）、CP214电子天平（奥豪斯仪器有限公司）、超纯水仪（韩国Human公司）。芦丁（批号：B20771，纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；DPPH、ABTS购自Sigma试剂公司；纤维素酶、果胶酶均为食品级，购自南宁庞博生物有限公司；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、三氯化铁均为分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。1.3试验方法1.3.1当归地上部分总黄酮的提取精密称取当归地上部分（茎∶叶=1∶1）粉末3.0 g，过4号筛（65目），置于具塞三角瓶中，按不同液料比加入不同浓度的乙醇溶液，密塞摇匀，50 ℃、250 W超声一定时间，调节溶液pH值为4.5，按照纤维素酶∶果胶酶（2∶1）比例加入不同量的双酶，放入50 ℃水浴锅中保温酶解反应一定时间，取出，摇匀，4 000 r/min离心15 min；精密量取上清液5 mL，定容至10 mL容量瓶中，得到当归地上部分总黄酮提取液。1.3.2当归地上部分总黄酮含量测定参考李志强等[9]方法，以芦丁为对照品，绘制标准曲线，吸光度A为纵坐标，芦丁浓度C为横坐标。A=10.594C－0.018(R2＝0.999 3)(1)芦丁对照品质量浓度为0.015～0.090 g/L。按照下式计算当归地上部分总黄酮提取率（X）X=(C×V×D)/m×100%(2)式中：C为标准曲线中计算出的总黄酮浓度（g/L）；V为提取液体积（mL）；D为稀释倍数；m为取样量（g）。1.3.3单因素试验设计（见表1）精密称取当归地上部分粉末3.0 g，其他提取条件保持一致。设置液料比30∶1、乙醇浓度30%、超声时间15 min、双酶（维素酶∶果胶酶=2∶1）用量0.2 g/L、酶解时间30 min，分别按照设置的数值固定其中4个因素，考察另一个因素对当归地上部分总黄酮提取率的影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.019.T001表1单因素试验设计水平液料比/(mL/g)乙醇浓度/%超声时间/min双酶用量/(g/L)酶解时间/min120∶130100.130230∶140200.260340∶150300.490450∶160400.6120560∶170500.8150670∶180601.01801.3.4Box-Behnken响应面试验设计在单因素试验的基础上，分析对单因素试验结果。选取对总黄酮提取率影响较大的因素为独立变量，以当归地上部分总黄酮提取率为响应值，设计响应面试验。1.3.5抗氧化活性测定1.3.5.1DPPH自由基清除能力配制0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液。参考Dong等[10]测定方法，将当归地上部分总黄酮配制成不同浓度的溶液，分别取所配溶液各2 mL，均加入2.0 mL DPPH乙醇溶液，快速混匀，室温下避光反应30 min，测定517 nm处吸光度，VC为阳性对照。计算样品的DPPH自由基清除率。Y=[A0－(AS-AS0)]/A0×100%(3)式中：Y为DPPH自由基清除率；A0为空白组的吸光度值；AS为不同样品吸光度值；AS0为样品自身吸光度值。1.3.5.2ABTS自由基清除能力参考Souza等[11]方法，将5 mL 7 mmol/L的ABTS溶液和5 mL 2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液混合摇匀，室温中避光静置12 h，使用乙醇稀释ABTS工作液至734 nm下的吸光度为0.70，取不同浓度的样品溶液50 L添加2 mL ABTS工作液，充分混合，室温避光反应6 min，测定734 nm处吸光度，以VC为阳性对照。计算样品的ABTS自由基清除率。T=(1-AS/A0)×100%(4)式中：T为ABTS自由基清除率；A0为空白组的吸光度值；As为不同样品吸光度值。1.3.5.3FRAP抗氧化能力参考Jin等[12]方法，取浓度为0.3 g/L的样品溶液0.5 mL于10 mL具塞比色管中，加入5 mL FRAP工作液（现用现配）充分混匀，37 ℃水浴30 min后，593 nm处测定反应液的吸光度。以不同浓度的VC系列溶液绘制标准曲线（y=5.477 9x+0.002 3，R2=0.999 3）；以每克样品中VC相当含量表示各样品的抗氧化能力（单位为mg VC eq/g sample）。1.4数据统计与分析采用Design-Expert 8.0软件进行响应面分析，采用Microsoft Excel 2010整理数据，采用SPSS进行单因素方差分析。2结果与分析2.1单因素试验（见图1）图1各因素对当归地上部分总黄酮提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.019.F1a1（a）液料比对总黄酮提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.019.F1a2（b）乙醇浓度对总黄酮提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.019.F1a3（c）超声时间对总黄酮提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.019.F1a4（d）双酶用量对总黄酮提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.019.F1a5（e）酶解时间对总黄酮提取率的影响由图1（a）可知，随着液料比增加，总黄酮提取率逐渐升高。因为随着溶剂比例的提高，当归地上部分粉末与提取溶剂的接触面积增大有利于黄酮类成分溶出，当液料比达到50∶1时，提取率达到最大值，溶剂比例过大会增加浓缩成本以及提取过程中的损耗。因此确定最佳液料比为50∶1。由图1（b）可知，随着乙醇浓度增加，总黄酮提取率逐渐升高。当乙醇浓度为50%时，提取率达到最大值7.47%，随后下降，可能因为当归地上部分既含有游离黄酮又含有可溶于水的黄酮苷类。最终确定最佳乙醇浓度为50%。由图1（c）可知，随着超声提取时间增加，总黄酮提取率在10~40 min呈现上升趋势，在40 min时提取率达到最大（7.65%）。结果表明，当归地上部分总黄酮在40 min内达到最大溶出量，长时间超声提取不会使提取率进一步提高，反而增加能源消耗，可能会使待提取物质结构发生改变。确定最佳超声时间为40 min。由图1（d）可知，双酶用量对总黄酮的提取率影响很大，因为当归地上茎杆和叶中含有的大量纤维素类和果胶类成分会影响其活性成分溶出，尤其是纤维素类成分，这是本研究确定双酶比例为（纤维素酶∶果胶酶=2∶1）的原因。在双酶用量为0.6 g/L时，当归地上部分总黄酮提取率最高。由图1（e）可知，酶解时间在90 min之前时，总黄酮提取率随酶解时间延长而升高，90 min以后趋于平缓。可能因为此时大部分纤维素和果胶已被完全降解，从节约时间考虑，确定酶解反应时间为90 min。2.2响应面试验2.2.1响应面试验设计及结果（见表2~表4）根据单因素试验结果，在固定液料比50∶1、乙醇浓度50%条件下，选取超声时间（A）、双酶用量（B）、酶解时间（C）3个因素为变量，以当归地上部分总黄酮的提取率（X）为响应值，采用Box-Behnken法设计3因素3水平响应面试验。响应面试验设计因素及水平见表2，响应面试验结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.019.T002表2响应面试验设计因素及水平水平A（超声时间）/minB（双酶用量）/(g/L)C（酶解时间）/min-1300.4700400.6901500.811010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.019.T003表3响应面试验结果试验号ABC总黄酮提取率/%1-1-107.3521-107.553-10-17.6241017.8050008.1360-117.497-1017.748-1107.8690-1-17.31100008.161110-17.75120008.171301-17.87141107.82150008.12160117.98170008.18使用Design－Expert 8.0.6软件对试验数据进行二次响应面回归分析，得到如下多元二次回归方程：X=8.15+0.044A+0.23B+0.058C－0.06AB－0.018AC－0.018BC－0.22A2－0.29B2－0.21C2 (5)由表4可知，该模型显著性检验的P值0.000 1，表明该模型具有统计学意义；失拟项P值为0.066 80.05，调整系数R2Adj=0.975 9，C·V·为0.57，说明回归模型拟合较好，能较准确反应3个因素对当归地上部分总黄酮提取率的影响；从F值可以得出各因素对当归地上部分总黄酮提取率的影响为双酶用量酶解时间超声时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.019.T004表4回归模型方差分析方差来源平方和自由度均方F值P值显著性R2（Adj）=0.975 9，C·V·=0.57模型1.2890.1472.880.000 1**A0.01510.0157.820.026 7*B0.4210.42213.810.000 1**C0.02610.02613.510.007 9**AB0.01410.0147.350.030 1*AC0.001 22510.001 2250.630.454 9BC0.001 22510.001 2250.630.454 9A20.2110.210105.040.000 1**B20.3410.340175.910.000 1**C20.1710.17089.060.000 1**残差0.01470.001 958失拟项0.01130.003 6755.490.066 8纯误差0.002 6840.000 67总回归1.3016注：**表示差异极显著（P0.01），*表示差异显著（P0.05）。2.2.2方差和交互作用分析由表4方差分析中的A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2和C2的P值和图2各因素两两交互作用3D响应面和等高线图可知，超声提取时间对总黄酮的提取率有显著影响（P0.05），双酶用量和酶解时间对总黄酮提取率有极显著影响（P0.01），均在响应面曲线坡度陡峭程度上得到验证，双酶用量的曲面最为陡峭，酶解时间次之。超声时间和双酶用量的等高线较陡峭，说明两者交互作用对总黄酮的提取率影响显著，而酶解时间与超声时间、双酶用量几乎无交互作用。图2各因素交互作用对当归地上部分总黄酮提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.019.F2a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.019.F2a210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.019.F2a32.2.3最优提取条件的确定及验证根据响应面分析得到最优提取条件为超声时间40.41 min、双酶用量0.68 g/L、酶解时间92.47 min，此条件下，当归地上部分总黄酮提取率理论值可达8.20%。考虑到实际可操作性，在乙醇浓度50%、液料比50∶1的前提下，调整超声时间41 min、双酶用量0.68 g/L、酶解时间为93 min，得到实际总黄酮提取率为8.18%，与理论值相差0.02%，说明此模型预测性好且较稳定，可用于当归地上部分中总黄酮的提取。2.3当归地上部分总黄酮抗氧化能力评价（见图3、图4、表5）畜禽体内的抗氧化系统无法清除自由基时，会产生氧化应激反应，使畜禽的抗病能力、生产性能下降[13]。黄酮类化合物除能够直接捕捉和络合自由基，通过激活机体内部抗氧化系统来发挥抗氧化作用[14]，从而减少畜禽氧化损伤。由图3可知，当归地上部分的总黄酮有较强的DPPH自由基清除能力。在总黄酮浓度为10~100 mg/L时，DPPH自由基清除率随着浓度的升高而增大，且变化较快；在浓度为150 mg/L时，清除率最大可达到90.3%，略低于VC，可能与当归地上部分的总黄酮中含有多羟基的黄酮类化合物有关，黄酮类成分含有的酚羟基是一种氢供体，具有很强的抗氧化能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.019.F003图3当归地上部分总黄酮DPPH自由基清除能力注：AP表示当归地上部分总黄酮；下图同。由图4可知，当归地上部分对ABTS自由基的清除能力与DPPH自由基清除能力的走势相似，均在较低浓度时上升较快，一定浓度后趋于平缓，直至达到最强的清除能力。总黄酮浓度为3 000 mg/L时，对ABTS清除率为88.6%，说明当归地上部分总黄酮对ABTS自由基具有一定的清除作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.019.F004图4当归地上部分总黄酮ABTS自由基清除能力由表5可知，ABTS的IC50为DPPH IC50的近30倍，说明当归地上部分总黄酮对DPPH自由基具有更强的清除能力。铁离子总还原力的测定用来确定各样品是否具有潜在的抗氧化活性。用VC建立的标准曲线进行换算，以VC相当含量表示各样品的抗氧化能力，当归地上部分总黄酮的FRAP抗氧化能力较强为4.64（mg VC eq/g sample）。另外当归地上部分总黄酮对DPPH、ABTS自由基清除力与FRAP抗氧化能力的大小存在差异，可能与化学成分含量和组成不同有关，同时也可能与不同抗氧化方法考察的抗氧化活性的不同方面有关。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.019.T005表5当归地上部分总黄酮清除DPPH、ABTS的IC50及FRAP抗氧化能力分析结果样品IC50FRAP抗氧化分析结果/(mg VC eq/g sample)DPPH/(mg/L)ABTS/(mg/L)当归地上部分总黄酮57.79±1.541 498.69±23.024.64±0.163结论本研究采用超声联合双酶法对当归地上部分的总黄酮进行提取，集合超声波和酶两种提取方法的优点，通过超声波振动破坏植物细胞壁，使细胞壁得到软化，促进细胞内物质的移动，纤维素酶和果胶酶的加入能够分解阻止有效成分溶出的纤维和果胶，使黄酮类成分更易溶出[15-16]。通过单因素和Box-Behnken响应面试验，确定出当归地上部分总黄酮的最佳提取条件为在乙醇浓度50%、液料比50∶1前提下，调整超声时间41 min、双酶用量0.68 g/L、酶解时间93 min，此条件下，总黄酮提取率为8.18%，与模型预测值极为相近。通过DPPH、ABTS自由基清除力和FRAP的抗氧化结果明确当归地上部分总黄酮有较强的自由基清除能力和抗氧化活性，具有开发成饲料添加剂和兽药的潜力。