饲用微生态制剂是指具有保持动物消化道微生态菌群平衡、提高宿主免疫力、选择性促进宿主正常菌群生长功能的物质制剂总称[1]。饲用微生态制剂进入动物体内后会与动物体内正常菌群结合，通过外源有益菌介入的方式来抑制机体内有害微生物的生长，保持机体内的正常微生态平衡，提高动物健康水平和生产性能[2-4]。大豆黄浆水是豆腐生产过程中的副产物，富含大豆里大部分水溶性物质，含有蛋白质、糖、大豆异黄酮、皂苷、钾、钠、维生素和蛋白酶抑制剂等多种成分，是适宜微生物生长的优良基质。但我国产出的黄浆水多被直接排放，造成环境污染和资源浪费[5-6]。L. casei YQ336是从自然发酵豆腐黄浆水中分离出的1株产酸能力强的干酪乳杆菌[7]，该菌能够在大豆黄浆水中快速增殖并产生L-乳酸，是利用豆腐副产物生产饲用微生态制剂的潜在菌种[8]。将L. casei YQ336以5%接种量在37 ℃下培养24 h纯种发酵黄浆水制备液体微生态制剂，其活菌数为1.71×109 CFU/mL，可以在畜牧生产中广泛应用。但在实际生产使用中，种子液的生产技术限制了广大豆腐黄浆水利用者将其投入饲料的发酵使用，导致应用在实践生产中时出现接种量过大、发酵时间过长的问题，这是影响实用性和经济性的主要因素。因此，研究对L. casei YQ336进行高密度培养，旨在解决大豆黄浆水发酵生产过程中存在的技术屏障，提高发酵后种子液活菌数，降低接种量，为纯种发酵豆腐黄浆水应用提供微生态制剂，在实现资源利用降低成本的同时，为饲用微生态制剂的制备及工业化生产提供参考。1材料与方法1.1试验材料L. casei YQ336：锦州医科大学食品微生物实验室分离保藏菌种；MRS培养基：天津市科密欧化学试剂。基础培养基配方：葡萄糖20 g、乳糖2 g、乙酸钠1.7 g、酵母浸粉5 g、K2HPO4 2 g、增殖液1 000 mL。增殖液制备方法：取33 g绿豆、33 g黄豆、67 g甘薯洗净加蒸馏水至1 000 mL，加热煮沸15 min，120目筛过滤，得到增殖液。1.2试验方法1.2.1菌种活化冻存菌种在基础培养基中，37 ℃活化培养24 h。1.2.2发酵培养以5%为接种量将菌种接入100 mL培养基中，37 ℃发酵培养24 h，测活菌数。1.2.3活菌计数法活菌计数法参照国标GB 4789.35—2016。1.2.4单因素试验优化L. casei YQ336培养基以活菌数为指标，对碳源、氮源、增殖液比例、增殖液含量、无机盐进行优化。1.2.4.1碳源选择接种量5%、碳源20 g，分别选用葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、低聚糖、红糖，37 ℃培养24 h，测活菌数。1.2.4.2增殖液比例接种量5%、红糖20 g，增殖液中增殖因子绿豆、黄豆、甘薯比例分别为1∶1∶1、1∶2∶1、1∶1∶2、1∶2∶2、2∶1∶1，37 ℃培养24 h，测活菌数。1.2.4.3增殖因子含量接种量5%、红糖20 g，增殖液绿豆∶黄豆∶甘薯=2∶1∶1，增殖液中增殖因子含量分别为12%、16%、20%、24%、28%，37 ℃培养24 h，测活菌数。1.2.4.4氮源选择接种量5%、红糖20 g，增殖液绿豆∶黄豆∶甘薯=2∶1∶1，增殖因子含量28%，氮源5 g分别为酵母浸粉、大豆低聚肽、花生肽、豌豆蛋白粉、玉米肽、脱脂乳粉、无机氮源硫酸铵，37 ℃培养24 h测活菌数。1.2.4.5无机盐接种量5%、红糖20 g，增殖液绿豆∶黄豆∶甘薯=2∶1∶1，增殖因子含量28%，酵母浸粉5 g，无机盐5 g分别为乙酸钠、碳酸钙、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾，以不加无机盐的空白做对照，37 ℃培养24 h，测活菌数。1.2.5响应面法优化L. casei YQ336培养条件（见表1）在单因素试验基础上，采用响应面法优化培养条件，以接种量（A）、培养温度（B）、初始pH值（C）3个因素为自变量，以发酵后活菌数为响应值（Y），采用Design-Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken法设计3因素3水平响应面试验，确定最佳的发酵条件，响应面试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.018.T001表1响应面试验因素水平设计水平A（接种量）/%B（培养温度）/℃C（初始pH值）-15335.007355.519376.01.2.6L. casei YQ336生长曲线的绘制将L. casei YQ336接入优化好的培养基中，每隔2 h取样，测定细菌0~48 h的生长情况，进行细菌计数，绘制生长曲线。1.3数据统计与分析采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），利用Design-Expert 8.0.6响应面设计软件对数据进行处理，结果以“平均值±标准差”表示。数据柱形图采用Excel 2007制作。2结果与分析2.1L. casei YQ336培养基优化单因素试验2.1.1碳源对干酪乳杆菌L. casei YQ336生长的影响（见图1）由图1可知，与葡萄糖、乳糖、低聚糖、麦芽糖、蔗糖相比，红糖作为碳源时，干酪乳杆菌L. casei YQ336发酵后活菌数最高，为（7.50±0.25）×109 CFU/mL，显著高于其他5种碳源（P0.05）。可能的原因是红糖中含有丰富的维生素与微量元素如钙、铁、锌、铜、锰等，以供L. casei YQ336发酵利用。因此，试验碳源为红糖。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.018.F001图1碳源对干酪乳杆菌L. casei YQ336生长的影响注：字母不同表示差异显著（P0.05），字母相同表示差异不显著（P0.05）；图2~图5与此同。2.1.2增殖液比例对干酪乳杆菌L. casei YQ336生长的影响（见图2）由图2可知，绿豆、黄豆、甘薯制作增殖液的比例为2∶1∶1时，发酵所得活菌数显著高于其他4种（P0.05），活菌数为（7.80±0.21）×109 CFU/mL。原因可能是绿豆中蛋白质和氨基酸含量比黄豆和甘薯高，绿豆中所含营养物质有助于L. casei YQ336发酵。因此，试验增殖液比例为2∶1∶1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.018.F002图2增殖液比例对干酪乳杆菌L. casei YQ336生长的影响2.1.3增殖因子含量对干酪乳杆菌L. casei YQ336生长的影响（见图3）由图3可知，当增殖因子含量为28%时，L. casei YQ336发酵后所得活菌数显著高于其他4种（P0.05），为（8.00±0.15）×109 CFU/mL。原因可能是L. casei YQ336发酵生长过程中消耗营养物质较快，所以在初始培养基中需要较多的营养物质。因此，试验增殖因子含量为28%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.018.F003图3增殖因子含量对干酪乳杆菌L. casei YQ336生长的影响2.1.4氮源对干酪乳杆菌L. casei YQ336生长的影响（见图4）由图4可知，与大豆低聚肽、花生肽、豌豆蛋白粉、玉米肽、脱脂乳粉、硫酸铵相比，酵母浸粉作为氮源发酵L. casei YQ336所得的活菌数显著高于其他6种氮源（P0.05），为（8.40±0.25）×109 CFU/mL。原因可能是酵母浸粉中富含蛋白质、氨基酸、多肽、核苷酸、B族维生素、增殖液、微量元素等营养成分，可以满足L. casei YQ336发酵所需营养。所以，氮源为酵母浸粉。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.018.F004图4氮源对干酪乳杆菌L. casei YQ336生长的影响2.1.5无机盐对干酪乳杆菌L. casei YQ336生长的影响（见图5）乳酸菌发酵过程中，会不断产生乳酸，导致培养基pH值降低，酸度过低会抑制乳酸菌的生长，加入无机盐可以起到一定的缓冲效果，减缓培养液pH值下降速度，进而促进乳酸菌的生长。由图5可知，磷酸氢二钾作为L. casei YQ336发酵的无机盐时，发酵后活菌数显著高于乙酸钠、碳酸钙、磷酸二氢钾和空白对照组（P0.05)），为（9.20±0.21）×109 CFU/mL。因此，试验无机盐为磷酸氢二钾。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.018.F005图5无机盐对干酪乳杆菌L. casei YQ336生长的影响2.2响应面法优化L. casei YQ336培养条件（见表2、表3、图6~图8）试验以活菌数为指标，在单因素优化培养基组分基础上，选取L. casei YQ336培养条件中的接种量（A）、培养温度（B）、初始pH值（C）3个因素为自变量，以发酵后活菌数为响应值（Y），对L. casei YQ336培养条件进行响应面分析，Box-Behnken试验设计及结果见表2，方差分析见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.018.T002表2Box-Behnken试验设计及结果试验号ABC活菌数/(×109 CFU/mL)100015.8210-110.4310110.8400015.451-1010.4600015.3701111.8800015.3900015.3100-1112.7110-1-110.812-10112.813-10-111.91411011.415-11012.216-1-1012.41701-111.610.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.018.T003表3响应面试验方差分析方差来源平方和自由度均方F值P值显著性R2=0.992 8，R2Adj=0.983 5模型59.24096.580107.030.000 1**A4.96014.96080.670.000 1**B0.06110.0611.000.351 5C1.45011.45023.500.001 9**AB0.36010.3605.850.046 1*AC0.06310.0631.020.347 0BC0.72010.72011.750.011 0*A217.440117.440283.520.000 1**B213.420113.420218.140.000 1**C215.360115.360249.760.000 1**残差0.43070.061失拟项0.24030.0811.720.300 3误差项0.19040.047总和59.67016注：**表示差异极显著（P0.01），*表示差异显著（P0.05）。采用响应面试验中的Box-Behnken法对表2数据进行多远二次回归拟合，得到回归模型方程：Y=15.42-0.79A+0.087B+0.43C+0.30AB-0.13AC-0.42BC-2.03A2-1.78B2-1.91C2 (1)对该回归方程进行分析可知，3个因子对乳酸菌活菌数的影响程度为：接种量初始pH值培养温度。由表3可知，模型的A、C、A2、C2、AC极显著影响响应值。回归模型极显著（P0.01），失拟项不显著（P=0.300 30.05），说明回归方程拟合度高，误差小。决定系数R2=0.992 8，模型校正决定系数R2Adj=0.983 5，表明因变量与考察的自变量间线性关系显著。由图6可知，初始pH值为5.5时，接种量与培养温度之间的交互作用对发酵后L. casei YQ336活菌数有影响。在接种量一定的条件下，随着培养温度的增加，L. casei YQ336发酵后的活菌数呈先上升后下降的趋势。L. casei YQ336在温度过低和过高时菌体内酶活性会受到抑制。AB交互项达显著水平。等高线靠近接种量的轴向相对密集，说明接种量对乳酸菌发酵后的活菌数的影响比培养温度大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.018.F006图6接种量和培养温度对L. casei YQ336发酵后活菌数的影响由图7可知，培养温度为35 ℃时，接种量和初始pH值之间的交互作用对L. casei YQ336发酵后活菌数有影响，但未达到显著水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.018.F007图7接种量和初始pH值对L. casei YQ336发酵后活菌数的影响由图8可知，接种量为8.7%时，培养温度和初始pH值之间交互作用对乳酸菌发酵后活菌数有影响。BC交互项达显著水平。等高线靠近初始pH值的轴向相对密集，说明接初始pH值对L. casei YQ336发酵后的活菌数的影响比培养温度大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.018.F008图8培养温度和初始pH值对L. casei YQ336发酵后活菌数的影响根据Design-Expert 8.0.6软件求回归模型极值点，结果表明，最优组合为初始pH值5.5、接种量7%、发酵温度35 ℃。在此条件下，乳酸菌发酵后活菌数最高，为（1.58±0.25）×1010 CFU/mL。2.3L. casei YQ336的24 h生长曲线（见图9）在乳酸菌生长过程中，每隔2 h，在600 nm处对L. casei YQ336发酵后的培养液进行菌数测定，以OD值为指标，绘制48 h生长曲线折线图。由图9可知，L. casei YQ336在0~12 h处于生长期，12 h后进入对数期，12~20 h处于对数生长期，20 h后达到稳定期，选择对数期末期、稳定期前期为发酵终点，在第20 h停止培养。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.018.F009图9L. casei YQ336的24 h生长曲线3讨论培养基中碳源氮源是微生物营养代谢的重要底物，直接为微生物提供发酵培养必要的糖和氨基酸等营养物质以维持微生物进行正常生命活动[9]。增殖液可以调控微生物的生长代谢，刺激微生物生长。乳酸菌发酵产酸，直接影响培养基pH值，无机盐能够有效延缓pH值变化速度，起到缓冲的作用[10]。本试验中，L. casei YQ336培养基以红糖作碳源、酵母浸粉作氮源、磷酸氢二钾作缓冲盐、绿豆∶黄豆∶甘薯作为增殖液比例为2∶1∶1、增殖因子含量为28%时，发酵后活菌数最高。本研究培养基组成优化为初步优化，研究的培养基组成均为单一组分，为日后进一步研究乳酸菌高密度培养制备微生态制剂提供参考。接种量的大小会影响培养基中菌群密度，并不是单纯的呈正比关系。接种量过小，有效的活菌数不高，发酵效果差；接种量过大，群体密度大，营养物质不充足，生长条件受到限制，同样得不到较好发酵效果[11]。微生物体内的代谢活动均通过体内的相关酶催化，酶活直接影响菌体的发酵[12-13]。培养温度、pH值会直接影响菌体内酶活性。培养温度、pH值过高或者过低，均会降低酶的活性。本试验中，L. casei YQ336的最佳接种量为7%、最适培养温度为35 ℃、最适pH值为5.5。饲用微生态制剂具有调节肠道菌群[14]、提高饲料转化率、提高畜禽免疫力[15]作用，且无毒无害，能够很好地替代抗生素。文章通过优化L. casei YQ336培养基及培养条件，以获得更高活菌数作为饲用微生态制剂投入生产。L. casei YQ336作为制备饲用微生态制剂潜在菌种，在最佳条件下进行发酵培养，得到的活菌数为（1.58±0.25）×1010 CFU/mL，高于吴军林等[16]高密度培养乳酸菌R8后的活菌数（8.0×109 CFU/mL）和崔莉等[17]高密度培养乳酸菌NCU0101制备浓缩型蔬菜发酵菌粉得到活菌数7.83×109 CFU/mL。优化后与优化前发酵所得活菌数1.71×109 CFU/mL相比提高一个数量级，活菌数接近优化前10倍，接种量为1%时便可达到优化前的活菌数，降低种子液发酵成本。应用L. casei YQ336制备微生态制剂，可以解决各地使用黄浆水作为种子液发酵时的技术屏障，降低接种量，缩短发酵时间，提高黄浆水发酵的实用性和经济性，同时使黄浆水中营养成分得到充分利用，畜禽食用后可有改善生产性能、增强免疫力的效果。4结论本研究表明，最佳培养基组成为红糖20 g、酵母浸粉5 g、无机盐5 g、磷酸氢二钾5 g，绿豆∶黄豆∶甘薯为2∶1∶1的增殖液1 000 mL。最优培养条件为接种量7%、培养温度35 ℃、初始pH值5.5、培养时间20 h。在该发酵条件下，L. casei YQ336发酵后活菌数为1.58×1010 CFU/mL，比优化前发酵所得活菌数1.71×109 CFU/mL提高一个数量级。