黑沙蒿（Artemisia ordosica）为菊科蒿属龙蒿亚属植物，主要分布在我国内蒙古、甘肃、宁夏和陕西等地[1]。在我国北部地区，黑沙蒿具有良好的防风固沙作用[2]。据报道，黑沙蒿富含醇类、酚类、有机酸、糖类和萜类等多种生物活性成分[3-4]，这些生物活性成分能够治疗鼻炎和鼻窦炎[5]，具有一定免疫调节[6]和抗氧化[7]特性。黑沙蒿水提物（water extract of Artemisia ordosica，WEAO）提取工艺简单、易于制备、成本较低，在畜禽生产中具有广泛应用前景。Xing等[8]发现，WEAO能够提高断奶仔猪血清中抗氧化酶活性和调节免疫因子活性。也有报道指出，黑沙蒿多糖能够促进大鼠生长，提高抗氧化功能[9]。此外，本课题组前期研究显示，WEAO能够缓解免疫应激状态下肉仔鸡的免疫应激反应[10]。目前，对于WEAO的毒性研究鲜见报道。因此，本试验利用WEAO对小鼠灌胃给药，观察小白鼠产生的急性毒性和慢性毒性反应，测定对小白鼠的LD50及其95%可信限，并对WEAO的饲用安全性进行评价，为WEAO的安全使用提供依据，也为WEAO的进一步开发利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料在内蒙古鄂尔多斯境内采集新鲜的全株黑沙蒿地上部分，在室温下阴干，切成小段。称取200 g进行煎煮，每批样品煎煮3次，每次加入的水量分别为1 000、800、500 mL。将3次所得滤液混合放入旋转蒸发仪浓缩，浓缩后在冻干机中冻干，所得冻干粉即为黑沙蒿水提物。昆明（SPF级）小白鼠购自内蒙古医科大学实验动物中心。1.2试验设计与饲粮本试验小白鼠所用饲粮为维持型鼠粮，购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司。基础饲粮营养水平见表1。饲养试验在内蒙古医科大学实验动物中心进行。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.020.T001表1基础饲粮营养水平营养水平含量水分10.00粗蛋白18.00粗脂肪4.00粗纤维5.00粗灰分8.00钙1.00总磷0.60赖氨酸0.82蛋氨酸+胱氨酸0.53单位/%1.2.1WEAO对小白鼠急性毒性试验试验采用完全随机试验设计，挑选4周龄雄性昆明小白鼠24只，随机分成4组，每组6只小白鼠，各组初始体重一致（P0.05）。试验开始前12 h，小白鼠只饮水，不采食。各给药剂量组根据体重计算给药剂量，分为对照组、2 g/kg BW组、4 g/kg BW组和6 g/kg BW组。采用金属灌胃针一次性灌服WEAO，对照组不做处理。试验期7 d，每天在固定时间点观察4次，连续观察7 d。1.2.2WEAO对小白鼠慢性毒性试验试验采用完全随机试验设计，体重相近的48只4周龄雄性昆明小白鼠，随机分为4组，每组12只小白鼠，各组初始体重一致（P0.05）。各给药剂量组根据体重计算给药剂量，分为对照组、0.5 g/kg BW组、1 g/kg BW组和2 g/kg BW组。试验期共27 d，持续灌胃20 d后，连续观察7 d，给药方法同1.2.1。1.3样品采集试验第27 d称重，使用无水乙醚将小白鼠麻醉，用抗凝采血管从小白鼠眼眶静脉丛取血，将采血管倾斜45°静置后在4 000 r/min离心15 min，取血清置于离心管中保存于-20 ℃备用。采用颈椎脱臼法将各组小白鼠处死，采集肝脏、脾脏和肾脏，并用吸水纸清除其上的血液，称重。1.4测定指标及方法1.4.1存活数观察并记录急性毒性试验中动物的临床表现及存活数。1.4.2器官指数将小白鼠用无水乙醚麻醉后，打开胸腔，心脏采血后，打开腹腔，采集组织样品，记录肝脏、脾脏、肾脏重量。计算肝脏指数、脾脏指数、肾脏指数。肝脏指数=肝脏重/活体重（1）脾脏指数=脾脏重/活体重（2）肾脏指数=肾脏重/活体重（3）1.4.3血清肝功能按照日立7020全自动血液生化分析仪的说明书，使用乐普（北京）诊断技术股份有限公司提供的试剂盒，测定血清中丙氨酸氨基转氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）活性和总胆红素（TBIL）、总蛋白（TP）和白蛋白（ALB）的含量。1.4.4血清肾功能按照日立7020全自动血液生化分析仪的说明书，使用乐普（北京）诊断技术股份有限公司提供的试剂盒，测定血清中尿素（UREA）、肌酐（CRE）的含量。1.5数据统计与分析数据采用Excel软件整理，采用SAS软件进行回归分析。P0.05表示差异显著，P0.01表示差异及显著。2结果与分析2.1WEAO急性毒性试验对小白鼠存活情况的影响（见表2）由表2可知，按体重灌胃WEAO 1 w后，各剂量组小白鼠均未出现死亡情况。此外，观察发现，与对照组相比，各剂量组小白鼠采食、饮水和活泼程度无明显区别。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.020.T002表2WEAO急性毒性试验对小白鼠存活情况的影响组别小鼠数/只存活数/只存活率/%对照组661002 g/kg BW组661004 g/kg BW组661006 g/kg BW组661002.2WEAO对小白鼠末重的影响（见表3）由表3可知，随着WEAO剂量增加，小白鼠末重未呈明显剂量依赖效应。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.020.T003表3WEAO对小白鼠末重的影响项目末重/g对照组44.330.5 g/kg BW组46.331.0 g/kg BW组48.332.0 g/kg BW组45.58SEM1.61线性P值0.656二次曲线P值0.2482.3WEAO对小白鼠器官指数的影响（见表4）由表4可知，小白鼠灌胃不同剂量WEAO 3 w后，小白鼠的肝脏、脾脏和肾脏指数未随WEAO剂量的增加10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.020.T004表4WEAO对小白鼠器官指数的影响项目肝脏指数脾脏指数肾脏指数对照组48.802.88224.200.5 g/kg BW组47.603.37235.901.0 g/kg BW组44.603.57192.702.0 g/kg BW组45.702.76242.80SEM1.820.3928.73线性P值0.1980.8250.748二次曲线P值0.2630.440.792%呈现出显著剂量依赖效应。2.4WEAO对小白鼠血清肝功能的影响（见表5）由表5可知，小白鼠灌胃不同剂量WEAO 3 w后，小白鼠血清中ALT、AST、ALP活性和TBIL、TP、ALB含量未随WEAO剂量的增加呈现显著剂量依赖效应。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.020.T005表5WEAO对小白鼠血清肝功能指标的影响项目ALT/(U/L)AST/(U/L)ALP/(U/L)TBIL/(μmol/L)TP/(g/L)ALB/(g/L)对照组88.40122.10116.803.6956.9029.600.5 g/kg BW组67.5054.20101.503.6556.3029.101.0 g/kg BW组75.7091.60125.103.5555.6029.902.0 g/kg BW组83.4091.80111.303.2756.5030.40SEM9.4917.415.260.271.090.63线性P值0.8380.6950.8080.3250.7080.274二次曲线P值0.510.1510.9430.5870.7620.435注：肝功能指标的参考范围：TBIL（0.6~8.2 μmol/L）、ALP（45~125 U/L）、ALB（28~44 g/L）、TP（41~62 g/L）、AST（42~106 U/L）、ALT（25~74 U/L）。2.5WEAO对小白鼠血清肾功能的影响（见表6）由表6可知，小白鼠灌胃不同剂量WEAO 3 w后，小白鼠血清中CRE含量未随WEAO剂量升高呈显著的剂量依赖效应。而血清中UREA含量随WEAO剂量的升高呈极显著的一次线性或二次曲线降低效应（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.020.T006表6WEAO对小白鼠血清肾功能指标的影响项目CRE/(μmol/L)UREA/(mmol/L)对照组30.508.820.5 g/kg BW组34.207.081.0 g/kg BW组33.006.852.0 g/kg BW组33.206.29SEM1.890.58线性P值0.4860.002二次曲线P值0.5280.002注：肾功能指标的参考范围：CRE（30~40 μmol/L）、UREA（2.8~8.2 mmol/L）。3讨论3.1WEAO对小白鼠的急性毒性本试验中，小白鼠在灌胃最大剂量6.0 g/kg BW时未出现死亡情况；与对照组相比各剂量组小白鼠采食、饮水和活泼程度无明显区别。根据农业农村部规定的化学物质急性毒性（LD50）剂量分级标准，LD506 g/kg，判定WEAO属实际无毒物质，无须测定半数致死量（LD50）。因此，可进行下一步慢性毒性试验。3.2WEAO对小白鼠的慢性毒性血清中AST、ALT、ALP、TBIL、TP和ALB等指标可反映肝功能[11]。ALT是肝细胞损伤时最先释放的酶，ALT水平通常被用来评价特异性肝细胞损伤。AST存在于肝细胞的细胞质和线粒体中，当肝细胞膜受损时，这两种酶都会被越来越多地释放到血液中，但并不代表着肝细胞坏死。ALP是一种存在于骨骼、肝脏、肠道、肾脏、白细胞和胎盘中的酶。ALP是胆汁淤积性肝病中最先升高的酶，并释放到血清中[12-13]。血液生化指标反映营养物质的吸收利用率。TBIL是检测肝功能的重要指标，血清中TBIL含量升高意味着肝脏受损[14]。TP由白蛋白和球蛋白组成，反映机体对蛋白质吸收以及与体液免疫的关系；当该指标增加时，可增强组织蛋白沉积，促进组织器官发育。ALB是血清胶体渗透压的主体，是血液中低水溶性物质的转运载体，在肝脏蛋白质代谢中起关键作用[15]。试验表明，小白鼠灌胃不同剂量WEAO后，小白鼠血清中ALT、AST、ALP活性和TBIL、TP、ALB含量未随WEAO剂量增加呈明显的剂量依赖效应，表明该剂量范围的WEAO对机体未造成损伤，WEAO为无毒性化合物。血清中CRE和UREA是评价肾功能的重要参数，二者超出正常范围时，肾功能发生损伤[9,11,16]。在本试验中，各剂量组血清CRE浓度无差异，而血清中UREA浓度随WEAO剂量增加呈现一次线性和二次曲线降低效应，但均在正常范围内。说明WEAO未对肾脏造成不良影响，反而有助于机体代谢，在一定范围内降低UREA浓度，可以改善小白鼠肾功能。此外，在本试验中，小白鼠末重、肝脏、脾脏和肾脏指数未随WEAO剂量增加呈明显的依赖效应，说明WEAO对末重和3种脏器的发育无不利影响。这一点与灌胃WEAO未对血清肝功能和肾功能生化指标产生负面效应相一致。4结论小白鼠灌胃6 g/kg BW WEAO，小白鼠生命表征正常，未出现死亡，表明WEAO为无毒性物质。白鼠灌胃0.5~2.0 g/kg BW WEAO未对体重、肝功能和肾功能指标产生负面影响，且不影响肝、脾、肾脏器官的发育。