厚朴为木兰科植物厚朴或凹叶厚朴的干皮、根皮和枝皮[1]，含有丰富酚类、生物碱、挥发油及多糖等物质[2]。研究表明，厚朴具有防腹泻、促进肠胃排空、抗炎和保护肝脏等作用[3]。与玉米、豆粕等常规原料相比，厚朴可以为动物提供营养成分[4]，提高动物群体健康，增强机体免疫力。因此，通过加工方式提高厚朴中活性成分的利用率具有重要意义。本试验以厚朴为对象，采用超微粉碎加工方式，考察超微粉碎机工艺参数对厚朴粉碎物中厚朴总酚含量的影响，对添加剂厚朴产品质量标准提出相应建议。1材料与方法1.1试验材料厚朴购自湖南和广生物科技有限公司。1.2试剂与仪器研究仪器：ZFJ-20型超微粉碎机（江阴市佳科机械制造有限公司）、FW100型高速万能粉碎机（上海书培实验设备有限公司）、低速离心机（巩义市宏华仪器设备工贸有限公司）。检测仪器：Waters ARC高效液相色谱仪（包含紫外检测器、二元高压梯度泵、真空脱气机、柱温箱、自动进样器、色谱工作站）、超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、电子分析天平（青岛聚创环保集团有限公司）等和紫外分光光度计（上海美析仪器有限公司）。分析纯与标准品：无水乙醇（General-reagent）、色谱级乙腈（Merck）和超纯水（Elga）。厚朴对照药材（中国食品药品检定研究院），厚朴酚与和厚朴酚标准品（中国药品生物制品检定所）。色谱条件参考《中国兽药典》：色谱柱Sunfire C18（4.6×250 mm，5 µm），流动相为甲醇∶水=78∶22，进样量5 µL，流速1.0 mL/min，紫外检测波长294 nm，柱温35 ℃。标准曲线建立[5]：精确称量标准品厚朴酚0.048 g与和厚朴酚0.067 g于100 mL标准容量瓶中，用甲醇定容、混匀，得到厚朴酚、和厚朴酚的混合标准液。分别将混合标准液稀释至厚朴酚浓度4.48、22.40、112.00、156.80、224.00 mg/L，和厚朴酚6.70、33.50、167.50、234.50、335.00 mg/L的混合标准工作液，以上述色谱条件进行检测，以峰面积对质量浓度绘制成标准曲线。1.3检测方法精确称取厚朴样品0.05 g于100 mL容量瓶中，采用甲醇定容，超声提取30 min后静置，采用0.45 µm滤膜过滤，以5 µL体积进样，保留时间定性。用峰面积计算厚朴酚、和厚朴酚含量，对比标准曲线得到厚朴酚与和厚朴酚的浓度后计算厚朴酚与和厚朴酚的百分含量。厚朴总酚含量为厚朴酚与和厚朴酚含量之和。厚朴酚与和厚朴酚计算公式一致。Y=Ai×C×VWi×AS×100% (1)式中：Y为厚朴酚、和厚朴酚的含量；Ai为样品中厚朴酚、和厚朴酚相对应的峰面积；AS为标准品中厚朴酚、和厚朴酚的峰面积；Wi为样品质量（g）；C为标准品浓度（g/L）；V为样品的定容体积（mL）。1.4试验设计1.4.1单因素试验根据超微粉碎机工艺研究和实际生产需要将本研究中的目标工艺参数暂定为：主轴转速、粉碎功率、风机功率、分级轮功率和厚朴水分含量[6]。采用单因素轮换法依次考察主轴转速（4 000、4 100、4 200、4 300、4 400 r/min）、粉碎功率（18、20、22、2 426 kW）、分级轮功率（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 kW）和厚朴分水含量（6%、8%、10%、12%、14%）等各项参数对厚朴超微粉碎产物中总酚含量的影响。超微粉碎初始工艺参数为主轴转速4 200 r/min、粉碎功率24 kW、风机功率19 kW、分级轮功率5.0 kW、厚朴分水含量10%。1.4.2响应面试验根据单因素试验结果，取各项因素对厚朴总酚含量影响的最佳范围，进行响应面分析，以确定厚朴超微粉碎物中厚朴总酚含量最优参数。1.5数据统计与分析数据采用Design Expert 12软件进行分析，每个处理重复测定3次，结果以“平均值±标准差”表示。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1主轴转速对厚朴粉碎物中厚朴总酚含量的影响（见图1）由图1可知，随着主轴转速的升高厚朴超微粉碎物中厚朴总酚的含量呈上升趋势，最终趋于稳定，说明转速越高会使厚朴原料在粉碎过程中与机仓壁接触时间减少，进而降低原料与温度较高部位的接触时间，避免厚朴活性物质发生热反应[7]。因此，主轴转速最优区间为4 100~4 300 r/min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.020.F001图1主轴转速对厚朴粉碎物中厚朴总酚含量的影响2.1.2粉碎功率对厚朴粉碎物中厚朴总酚含量的影响（见图2）由图2可知，随着粉碎功率的提高，厚朴活性物质的含量呈先升高后递减趋势，可能是在规定时间内粉碎功率可在一定范围内提高，加快活性物质在细胞壁内释放[8]。但由于厚朴酚与和厚朴酚具有较强的化学活性，在相同时间内快速释放后容易发生化学反应，导致在25 kW时活性成分含量有所降低。因此，粉碎功率的最佳范围为22~26 kW之间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.020.F002图2粉碎功率对厚朴粉碎物中厚朴总酚含量的影响2.1.3分级轮功率对厚朴粉碎物中厚朴总酚含量的影响（见图3）由图3可知，分级轮功率对厚朴活性物质影响不明显，分级轮功率大小影响转速，转速越高分级粉粒越细。分级轮通过与风机交互作用，将高于目标粒度的原料重新甩回粉碎室继续粉碎，该工艺参数主要影响厚朴超微粉碎物的得率，对活性物质含量影响较小[8]。因此，分级轮功率不作为后续响应面分析的研究对象。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.020.F003图3分级轮功率对厚朴粉碎物中厚朴总酚含量的影响2.1.4水分含量对厚朴粉碎物中厚朴总酚含量的影响（见图4）由图4可知，随着水分含量提高，厚朴粉碎物中总酚含量呈递减趋势，在水分含量超过12%时下降比例较高，因为厚朴酚类物质在水分较多的情况下会加速化学反应的速率[9]。水分可能起到润滑作用而导致原料在粉碎机内与机器接触降低。水分含量较低的高品质厚朴多用于人的疾病治疗且价格昂贵，作为饲料原料水分含量超过8%的厚朴价格相对更低，更适用于注重成本的饲料生产，因此结合测定结果与饲料生产的实际情况，选择8%~12%作为响应面水分含量区间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.020.F004图4水分含量对粉碎物中厚朴总酚含量的影响2.2响应面分析2.2.1响应面试验因素水平设计（见表1）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.020.T001表1响应面试验因素水平设计水平A主轴转速/(r/min)B粉碎功率/kWC水分含量/%-14 10022804 200241014 3002612根据2.1项研究内容，确定厚朴超微粉碎主要待优化因素为主轴转速（A）、粉碎功率（B）和厚朴原料水分含量（C）。在Design Expert软件中使用Box-Behnken模块以厚朴总酚含量（D）最高为目标进行响应面优化分析。2.2.2响应面试验结果及方差分析（见表2、表3）根据Design Expert软件对表2数据进行拟合，得到拟合方程：D=-152.506+0.057 953A+2.474 5B+0.536 875C‒0.000 225AB‒0.000 013AC‒0.012 5BC‒6.225×10-6A2‒0.028 688B2‒0.009 312C2 (2)10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.020.T002表2响应面试验结果序号ABC厚朴总酚含量/%14 10022101.8924 30022101.9834 10026102.1244 30026102.0354 1002482.0764 3002482.1374 10024122.0484 30024122.0994 2002281.93104 2002682.11114 20022122.05124 20026122.03134 20024102.16144 20024102.17154 20024102.18164 20024102.21174 20024102.19由表3可知，建立的模型P0.01，失拟项P0.05，说明模型在具有较高的可靠性。根据P值分析，3种因素对厚朴总酚含量影响的重要程度依次为BAC，并且A、B二次项达到极显著水平（P0.01），C二次项达到显著水平（P0.05），且AB和BC的交互作用达到显著水平（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.020.T003表3响应面试验结果方差分析方差源平方和自由度均方F值P值显著性模型0.128 590.014 315.850 00.000 7**A0.001 510.001 51.680 00.236 1B0.024 210.024 226.870 00.001 3**C0.000 110.000 10.124 90.734 2AB0.008 110.008 18.990 00.020 0*AC0.000 010.000 00.027 80.872 4BC0.010 010.010 011.100 00.012 6*A20.016 310.016 318.110 00.003 8**B20.055 410.055 461.550 00.000 1**C20.005 810.005 86.490 00.038 3*残差0.006 370.000 9失拟项0.004 830.001 64.350 00.094 8误差项0.001 540.000 4总和0.134 816注：“*”表示影响显著；“**”表示影响极显著。2.2.3响应面试验交互作用分析（见图5~图7）由图5~图7可知，AB和BC的等高线为闭合椭圆形且响应面陡峭，说明AB和BC的交互作用存在最大值，与方差分析结果基本保持一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.020.F005图5主轴转速与粉碎功率对粉碎物中厚朴总酚含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.020.F006图6主轴转速与水分含量对粉碎物中厚朴总酚含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.020.F007图7水分含量与粉碎功率对粉碎物中厚朴总酚含量的影响2.2.4验证试验采用Design Expert软件，计算出最优工艺参数为：主轴转速4 201.04 r/min、粉碎功率24.581 6 kW、水分含量9.508 85%。通过优化工艺，做6次重复试验，得到厚朴粉碎物总酚含量，结果见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.020.T004表4优化工艺生产后的厚朴粉碎物总酚含量项目类型第1批次第2批次第3批次第4批次第5批次第6批次平均值厚朴总酚2.222.22.182.192.192.182.19%由表4可知，将工艺参数调整为主轴转速4 200 r/min，粉碎功率24 kW，水分含量9.5%，连续生产6批次对超微粉碎物酚类物质进行检测。3讨论厚朴中酚类活性物质含量受多种因素的影响。吴锦玉等[10]利用HPLC法，色谱条件为YMC-Pack-ODS-AQ色谱柱（250×4.6 mm I.D.S-5 µm，12 nm），以乙腈和0.2%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，波长为280 nm，柱温为30 ℃测定7个产地的厚朴中厚朴酚与和厚朴酚含量。结果显示，厚朴酚与和厚朴酚的平均含量分别在2.3~84.8 mg/L和1.05~21.00 mg/L范围内，认为厚朴酚与和厚朴酚差异的来源主要为区域气候、土壤环境及采收时间。瞿京红[11]研究厚朴采收后粗加工方式对厚朴总酚含量的影响，结果表明，制成原料前的粗加工工艺对厚朴总酚含量也具有显著影响。因此，在开发原料厚朴中需要对原料前处理工艺进行进一步研究，才能更高效利用厚朴中活性物质。曹蓉等[12]以黄羽肉鸡为研究对象，分别设置照组（饲喂基础饲粮）、抗生素组（1~28日龄饲喂基础饲粮+20 mg/kg多粘菌素E和12 mg/kg黄霉素，29~56日龄饲喂基础饲粮+12 mg/kg黄霉素）；厚朴总酚添加组（分别饲喂在基础饲粮中添加50、150和250 mg/kg厚朴总酚的饲粮）。结果表明，50 mg/kg厚朴总酚添加组黄羽肉鸡平均日采食量显著高于抗生素组，黄羽肉鸡料重比随厚朴总酚添加水平的提高呈现二次变化；50和150 mg/kg厚朴总酚组显著改善肉鸡屠宰性能和抗氧化性能，说明厚朴总酚类物质在养殖中具有较高的应用价值。4结论本试验条件下，ZFJ-20型超微粉碎机的主轴转速、粉碎功率及厚朴原料水分含量对厚朴超微粉碎物中的厚朴总酚有显著影响。在生产实践中，建议厚朴粉碎工艺最佳工艺参数主轴转速4 200 r/min、粉碎功率24 kW、水分含量9.5%最佳。